癌胚抗原的時(shí)間分辨免疫熒光分析及其診斷試劑的研制

1、論著 文章編號(hào):1007-8738(200601-0121-04癌胚抗原的時(shí)間分辨免疫熒光分析及其診斷試劑的研制杭建峰1,吳英松1,余偉鴻2,黃穎3,李明1*(1南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,廣東廣州510515;2廣州市達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司,廣東廣州510663;3中國(guó)藥品生物制品檢定所,北京100050收稿日期:2005-01-20;修回日期:2005-06-20基金項(xiàng)目:廣州市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目資助(No .2003U130021作者簡(jiǎn)介:杭建峰(1976-,男,內(nèi)蒙古呼和浩特人,醫(yī)師,碩士.*Correspond i ng au t hor ,Te l :(02061648550Em a

2、il :m i ngli fi mm u .comT m i e -resol ved fl uorom i m unoassay of carc i n o -e mbryon i c anti gen and prepa -rati on of it s d i agnostic reagentHA NG J ian -feng 1,WU Y i n g -song 1,YU Wei -hong 2,H UA NG Y i n g 3,LIM ing 1*1Schoo l of B iotechno logy ,Sou t hern M ed ica l U niversity ,G ua

3、ng -z hou 510515;2G uangzhou D a rui antibody Co .,L t d .,G uang zhou 510663;3N ational Institute f o r t he Con tro l of Pha r m aceutica l and Bio l og ical P roduce s ,Beijing 100050,ChinaAbstrac t AI M :To est ab lish a t w o -sit e tm i e -re so l v edfluo ro m i m unoassay (TRFI A f o r de te

4、cti o n o f ca rc i n o -emb ry -on ic anti g en (CEA based on t he d irect sand w ich t echn ique (O ne m onoc l o na l an ti b ody (mAb i s m i mob ilized on the sur -face o f m i c ro tit e r p l a te str i p we lls ,ano the r mAb i s l a be lled w ith Eu 3+and p repa re its d iag nostic reag en.

5、t M ETHO DS :The sandw ich TRFI A fo r de tecti o n o f se rum CEA leve l using an ti -CEA mAb s .RE SULT S :The measure range of CEA -TRFI A was (1-560g /L .The ana lytica l sens itivit y was 0.28g /L .The intra -and i n t e r -assay coe ffi c i e n ts o f var i a -tion (CV w ere 7.2%-8.6%and 8.9%-

6、13.2%,ca rc i n o -emb ryon ic an tigen (CEA ;tm i e -re -so lved fl u o rom i munossay (TRF I A 摘要目的:利用時(shí)間分辨免疫熒光分析(TRF I A 技術(shù),建立一種人血清癌胚抗原(CE A 的快速全自動(dòng)檢測(cè)方法并研制其診斷試劑。方法:采用雙抗體夾心法(用1株抗CEA 的mA b M 86160M 用于包被微孔板,另1株抗CEA 的mA b M 86110M 用于標(biāo)記銪建立CEA -TRF I A ,增強(qiáng)液采用-二酮體為主的發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)。結(jié)果:CEA -TRF I A 的線性測(cè)量范圍為(1560g /

7、L ,分析的靈敏度為0.28g /L ,批內(nèi)和批間的變異系數(shù)(CV 分別為7.2%8.6%和8.9%13.2%。與A FP 、CA 12-5、CA 19-9和白蛋白均無(wú)交叉反應(yīng),與CA 15-3的交叉反應(yīng)值為1.62g /L 。將1000份血清標(biāo)本用本法與國(guó)外羅氏化學(xué)發(fā)光試劑盒同時(shí)檢測(cè),其相關(guān)系數(shù)(r 為0.946。結(jié)論:CEA -TRF I A 的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到臨床檢測(cè)的要求,可替代國(guó)外同類(lèi)檢測(cè)試劑盒,用于臨床血清CEA 水平的測(cè)定。關(guān)鍵詞癌胚抗原;時(shí)間分辨免疫熒光分析中圖分類(lèi)號(hào)R 392.33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B隨著臨床檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步,定量檢測(cè)方法逐漸代替了定性檢測(cè)而被廣大臨床醫(yī)師所接受。血清

8、癌胚抗原(CEA 為一種傳統(tǒng)的廣譜腫瘤標(biāo)志物,其結(jié)構(gòu)為一種復(fù)雜的可溶性糖蛋白1。CEA 于1965年由G o l d 和Freed m an 首先從胎兒及結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn),相對(duì)分子質(zhì)量(M r 約為220000,主要存在于胎兒的胃腸道、胰腺和肝臟,出生后組織內(nèi)的含量很低。胃腸道惡性腫瘤患者的血清中CEA 的水平升高,在乳腺癌、肺癌及其他惡性腫瘤患者的血清中也有一定程度的升高。因此,CE A 雖然不能作為診斷某種惡性腫瘤的特異性指標(biāo),但在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)及療效評(píng)價(jià)等方面,仍有重要的臨床價(jià)值2。時(shí)間分辨免疫熒光分析(TRFI A 技術(shù)3,4,為近年興起的新型免疫學(xué)檢測(cè)方法,根據(jù)待檢物的

9、不同具有多種反應(yīng)模式(我們采用的為雙抗體夾心法。與國(guó)外相比較,該技術(shù)在國(guó)內(nèi)起步較晚,市面上的國(guó)產(chǎn)診斷試劑更為少見(jiàn)。為此,我們應(yīng)用TR -FI A 法對(duì)生產(chǎn)的3批CE A -TRFI A 診斷試劑進(jìn)行了各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)估,并與羅氏CE A 化學(xué)發(fā)光診斷試劑盒檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行了比較。1材料和方法1.1材料分別用于包被和Eu 3+標(biāo)記的兩株抗CEA mA b M 86160M 和M 86110M 、CEA 抗原、AFP 抗原、CA 12-5、CA 19-121ISSN 1007-8738細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(Chin J Ce llM o l I mmuno l 2006,22(1DOI 牶牨牥牣牨牫牬牪

10、牫牤j 牣cn ki 牣cjc mi 牣牥牥牫牳牬牰9及CA15-3,均購(gòu)自美國(guó)B i odesi gn公司。96孔微孔板(8×12為L(zhǎng)abs y st em公司產(chǎn)品。Sephadex G-50系Pha r m acia公司產(chǎn)品。Eu3+標(biāo)記試劑盒及專(zhuān)用Eu3+熒光增強(qiáng)液,均購(gòu)自Pe r-K i n E l m e r公司。CEA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控血清,均為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品。W a llac DELF I A T M CEA試劑盒和羅氏化學(xué)發(fā)光試劑盒(R oche CE A k it為美國(guó)-芬蘭P erk i n El m e r公司產(chǎn)品。血清標(biāo)本1000份(其中CEA陽(yáng)性標(biāo)

11、本556份,陰性標(biāo)本444份及健康人標(biāo)本425份,來(lái)自北京301醫(yī)院、南方醫(yī)院和廣州軍區(qū)總醫(yī)院。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。帶有濾膜的離心管為M illi pore公司產(chǎn)品。A uto-D e lfia1235全自動(dòng)時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)儀,為美國(guó)-芬蘭Pe rkin E l m er公司產(chǎn)品。1.2方法56m in。用標(biāo)記緩沖液(50mm o l/L、N a2CO3,pH9.5重復(fù)洗滌6次后,將200L標(biāo)記mAb和0.5m g Eu3+標(biāo)記試劑充分混勻,于4過(guò)夜。3的50mm o l/L p H7.8T ris-HC l緩沖液,將CE A抗原配制成1、5、10、100、560g/L系列濃度的標(biāo)

12、準(zhǔn)溶液,按每瓶1m L分裝凍干,于-20干燥保存。200L反應(yīng)緩沖液(含5g/L BSA、9g/L N aC l及1g/L N aN3的50mm o l/L p H7.8T ris-HC l緩沖液,于室溫震蕩孵育3h。用洗滌液(含9g/L N aC l、0.2g/L N aN3及0.3g/L Tw een80的50mmo l/L p H7.8T ris-HC l緩沖液洗板4次,再加入175稀釋的Eu3+標(biāo)記mAb200L,于室溫孵育1h。用洗滌液洗板6次,最后加入200L增強(qiáng)液振搖5m in檢測(cè)。全部過(guò)程均在A u t o-D e lfi a1235熒光檢測(cè)儀上完成。(6正常參考值范圍的測(cè)定:

13、用自制CE A-TRF I A試劑盒檢測(cè)425份健康人血清,統(tǒng)計(jì)檢測(cè)所得CEA濃度的分布。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。(7與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品的比較:用自行制備的CEA-TRF IA診斷試劑,檢測(cè)CEA陰、陽(yáng)性血清各30份,按試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,評(píng)估該試劑檢測(cè)的靈敏度及特異度等值。同時(shí),采用R oche CEA k it檢測(cè)血清樣本1000份(陽(yáng)性標(biāo)本556份,陰性標(biāo)本444份與用自制試劑檢測(cè)的結(jié)果相比較,并進(jìn)行相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1mAb M86110M的標(biāo)記率和回收率mA b M86110M的標(biāo)記率和回收率分別為9.58%和86%。 。圖1CEA-TRF I A劑量-

14、反應(yīng)曲線的準(zhǔn)確度F ig1A ccuracy o f dose-re s ponse cu rve fo r CEA-TRF I AA:Dose-response cu rve for nati onal standar d;B:Dose-respon s e cu r ve for reference st andard.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和分析靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1560g/L。以參考標(biāo)準(zhǔn)品A1測(cè)定值的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值扣除本底的熒光值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得最小測(cè)定值的濃度為0.28g/L,與國(guó)外CEA試劑盒中說(shuō)明書(shū)的規(guī)定(CEA的最小測(cè)定值為0.2g/L較為

15、相近。2.4自制CEA試劑檢測(cè)的精確度用自制CE A-TRF I A試劑分析,批內(nèi)的CV<10%,批間的CV<15%(表2。表1CE A-TRF I A試劑劑量-反應(yīng)曲線的準(zhǔn)確度Tab1A ccu racy of dose-response curve for CE A-TRF I A reagen t(n=8Ite mNS(g/L0(A1(B5(C10(D100(E560(FRS(g/L0.06(A100.11.06(B10.941.085.25(C2(D19.710.7104(E192106545(F1519583Ratio(RS/N S-1.060.941

16、.081.050.981.060.960.971.070.960.921.061.040.931.04NS=national standard;RS=reference st andar d.A-F:Concen tration of nati onal s t andard;A1-F1:C oncentrati on of reference st andar d.表2自制CEA試劑檢測(cè)的精確度Tab2A ccu racy de tected by se lf-m ade CEA reagent(n=8G roupIntra-assayLot No.040225CV(%LotNo.04040

17、5CV(%LotN o.040620CV(%In ter-assay3l ots CV(%2.5自制CEA試劑檢測(cè)的特異性將1×106U/L A FP、6×105U/L CA12-5、5×105U/L CA15-3、4×105U/L CA19-9及1×106g/L白蛋白,用自制的CE A-TRF I A試劑測(cè)定后,所獲CEA的水平依次為0、0、1.62、0、0g/L。2.6正常值范圍和ROC曲線用CEA-TRF I A試劑對(duì)425例健康查體者(男229例,年齡391歲;女196例,年齡8 90歲血清CE A的水平檢測(cè)表明,最低值為0g/L,最高

18、值為10.3g/L,平均濃度(x為2.76g/L,標(biāo)準(zhǔn)差(SD為1.88g/L。從表3和圖2的結(jié)果可以看出,大多數(shù)樣本(95.53%中的CE A濃度值在6.0g/L以下,均值加2個(gè)SD 等于6.52g/L;96.71%的標(biāo)本CEA的濃度值在6.5g/L 以下。綜合其他人的研究及臨床參考值,我們建議采用本試劑檢測(cè)時(shí),血清CEA水平的正常參考值范圍應(yīng)定為0 6.5g/L。各醫(yī)院使用本試劑檢測(cè)時(shí),根據(jù)各地區(qū)樣本的差異,建議設(shè)立自己的參考值范圍。將1000份臨床樣本用自制CE A-TRF I A試劑檢測(cè)的結(jié)果,用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,并繪制ROC曲線,ROC曲線下的面積為0.977(95%

19、的可信區(qū)間為0.9690.985。從曲線的圖形可以看出,用本試劑檢測(cè)血清CEA的效果良好。表3正常人血清CEA水平檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab3Sta tistica l analysis o f de t ec ting re s u lts o f se ru m CE A l eve l in healt hy ind i v i duals(n=425IndexCEA l evel(g/L -圖2健康人血清CEA正常值的范圍和RO C曲線F ig2N o r m al range o f serum CEA leve l in hea lt hy i ndividua l sand RO

20、C cu rve表4自制CE A試劑與國(guó)外W all ac-CEA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較Tab4Comparison de tecti ng results be t w een se lf-m ade CEA rea-gent andW a ll ac-CE A k itLinear range(g/L15601500Preci s i on(%CV<8.6CV<5S t abilit y>1year at4>1year at4圖3自制CEA試劑與Ro che-CEA試劑盒檢測(cè)血清CEA的相關(guān)性(回歸分析F i g3Correlati on(reg ression an

21、a l ysisof seru m CEA de t ec t ed byse lf-m ade CE A reagent and R oche CEA kit(r=0.9463討論TRF I A為一種超微量免疫分析檢測(cè)技術(shù),采用鑭系元素離子及其螯合物5-7標(biāo)記抗原或抗體。由于實(shí)現(xiàn)了原子標(biāo)記,對(duì)標(biāo)記物的影響較小,故靈敏度高,其反應(yīng)模式也有夾心法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法等多種形式,但其獨(dú)有的多標(biāo)記技術(shù)(最多可進(jìn)行四標(biāo)記,使之可以實(shí)現(xiàn)用一個(gè)樣本同時(shí)測(cè)定多種物質(zhì)的目的,與現(xiàn)有的檢測(cè)方法(放免法和化學(xué)發(fā)光法相比較,具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、標(biāo)記物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、可重復(fù)測(cè)量、不受樣品自然熒光干擾及無(wú)放射性污染等

22、優(yōu)點(diǎn)。以上優(yōu)勢(shì)是因?yàn)門(mén)RFI A具有獨(dú)特的熒光特性(特異性熒光的衰變時(shí)間極長(zhǎng),為傳統(tǒng)熒光的103106倍。激發(fā)光與發(fā)射光的之間的Stokes位移可達(dá)290n m;而普通熒光素的S tokes位移僅為28nm。由于其標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定,對(duì)于同批次檢測(cè)的試劑,可以設(shè)定參考曲線或使用兩點(diǎn)定標(biāo)進(jìn)行測(cè)量,以減少醫(yī)院檢測(cè)的成本。血清CE A水平的升高常見(jiàn)于大腸癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌及甲狀腺髓樣癌等,有報(bào)道認(rèn)為8,CEA超過(guò)20g/L時(shí),往往提示有消化道腫瘤;但吸煙、妊娠期、心血管疾病、糖尿病及非特異性結(jié)腸炎等疾病,15%53%的患者血清CE A的水平也會(huì)升高,所以CEA并非惡性腫瘤的特異性標(biāo)志。目

23、前,臨床上血清CEA的檢測(cè)有兩種方法:一種是放免法或化學(xué)發(fā)光法,另一種是免疫組化法,這兩種方法檢測(cè)的結(jié)果,均可反映腫瘤的組織類(lèi)型、臨床分期與分級(jí)、療效及治療后有否轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。對(duì)于定量診斷試劑而言,靈敏度要求非常重要,自制CE A試劑的靈敏度達(dá)到0.28g/L,與國(guó)外同類(lèi)試劑(W allac檢測(cè)的靈敏度(0.2g/L相比較,較為接近,但自制試劑的本底熒光值較高(可能是由于抗體的標(biāo)記和純化工藝不同所致。精確度也是評(píng)估診斷試劑性能的一個(gè)重要指標(biāo),對(duì)于自制試劑而言,無(wú)論是批內(nèi)還是批間的CV全部達(dá)到要求,說(shuō)明檢測(cè)的結(jié)果是穩(wěn)定的。特異性檢測(cè)的結(jié)果表明,用自制試劑檢測(cè)的特異性較強(qiáng),除與CA15-3有微弱的交

24、叉反應(yīng)外,與AFP、CA12-5、CA19-9及白蛋白均未見(jiàn)有交叉反應(yīng)。該法的正常值較化學(xué)發(fā)光法高,考慮可能是由于兩種方法所使用的抗原、抗體及緩沖體系不同所致。兩種方法的r值為0.946,說(shuō)明自制試劑對(duì)血清CEA的檢測(cè)結(jié)果是可信的。參考文獻(xiàn):1NI H C onsen s us s t ate m ent carcinoe m b r yon ic an ti gen;Its rol e as am arker i n t he m anage m en t of can cerJ.Cancer R es,1981,41: 2017-2021.2張?zhí)鞚?徐光煒.腫瘤學(xué)M.天津:天津科學(xué)技術(shù)版社

25、,1996:546-547.3Gail ard O,K apelN,G alli J,eta l.Ti m e-res o l ved fl uoro m etry:pri nci-ples and app li cati ons i n cli n i nal biol ogyJ.Ann B i o lCli n,1994,52(11:751-752.4Ras iS,Suvan t o E,V il po L M,et a l.Ti m e-res o l ved fl uoroi m m unoas-say of5-m et hyl-2-deoxyc y ti d i ne e m p l oying europ i