Neon 細胞電轉(zhuǎn)儀中文說明書(MPK5000)

1、一，簡單的3步驟程序。1.將收集到的細胞和待轉(zhuǎn)染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。2.將帶專用槍頭的移液器插入帶有電極杯的移液器座中; 在設(shè)備上選擇程序，然后按開始。3.拔下移液器，將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中。注：1. 為了避免污染，強烈建議只使用電極杯10次。建議在切換到不同質(zhì)粒DNA / siRNA或細胞類型時更換電極杯和緩沖液2. 為了確保重復(fù)性和排除轉(zhuǎn)染條件的變化，建議不要使用槍頭超過2次二，軟件操作程序1.按下電源開關(guān)（位于設(shè)備背面，第vii頁）打開Neon®設(shè)備。 本機檢查確保Neon®移液器站已連接到設(shè)備，然后顯

2、示啟動屏幕。2.按Voltage啟動數(shù)字鍵盤輸入電壓值。 按所需的電壓值，然后按Done保存該值。 注意：如果任何輸入值超出限制，則會顯示錯誤信息，并自動設(shè)置最小的限制值。3.按Width激活數(shù)字鍵盤輸入寬度值。 按所需的寬度值，然后按Done保存該值。4. 按Pulses激活數(shù)字鍵盤以輸入脈沖值。 按所需的脈沖值，然后按Done保存該值。5. 如果要保存這些電穿孔參數(shù)，請按主屏幕上的“Save”將程序保存在數(shù)據(jù)庫中。6. 按所需的程序號碼編輯程序。 選定的程序會突出顯示。7. 顯示“Edit”屏幕后，按鍵盤按鈕輸入用戶名。 光標(biāo)自動移動到下一個字段協(xié)議，并突出顯示為紅色。繼續(xù)輸入Voltag

3、e，Width和Pulses信息。8。按Enter鍵將信息保存在數(shù)據(jù)庫中。9. 繼續(xù)準(zhǔn)備細胞和DNA，并設(shè)置用于電穿孔的移液器座三，細胞與DNA混合物準(zhǔn)備注意事項：1. 將純化的DNA重懸于1-5g/L濃度的去離子水或TE緩沖液（10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0）中。 濃度可能因細胞類型而異。2. DNA量不應(yīng)超過使用總體積的10。3. 通過測量A 260/280比例來檢查純化的DNA制劑的純度。 電穿孔的比例應(yīng)至少為1.8。4. 該裝置已經(jīng)用4-7kb質(zhì)粒進行常規(guī)測試，質(zhì)粒高達約20kb不應(yīng)該是問題。 使用大于20 kb的質(zhì)粒很可能降低轉(zhuǎn)染效率。5. 不要用乙醇沉淀DN

4、A以濃縮DNA。 通過乙醇沉淀的濃縮DNA顯示差的轉(zhuǎn)染效率和由于鹽污染導(dǎo)致的細胞活力。6. 不含Ca2 +和Mg2 +的D-PBS或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（第40頁）流程：1. 用3 mL電解緩沖液（使用緩沖液E，10LNeon®Tip和Buffer E2，100LNeon®Tip）填充電轉(zhuǎn)杯。（確保管子側(cè)的電極完全浸入緩沖液中。）2. 將電極杯插入移液器座，直到聽到咔嗒聲。確保Neon®管的側(cè)面電極與Neon®移液器站的側(cè)球柱塞良好連接（見下圖左側(cè)正確位置）3. 在電穿孔前一天，將細胞轉(zhuǎn)移到具有新鮮生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，使得細胞在實驗當(dāng)天為70-90

5、匯合。4. 對于大多數(shù)優(yōu)化協(xié)議，每10LNeon®Tip可提供5×104-2×105個細胞。（5×105-2×106個細胞每100LNeon®Tip適用于大多數(shù)優(yōu)化的方案。）5. 將含有血清，PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）和胰蛋白酶/ EDTA溶液的培養(yǎng)基的等分試樣預(yù)溫至37。從培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)基，并使用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）沖洗細胞。使用胰蛋白酶/ EDTA或TrypLE Express（目錄號12563）對細胞進行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化細胞懸浮液并計數(shù)細胞以確定細胞密度。將細胞轉(zhuǎn)移到1.5mL微量離

6、心管或15mL錐形管中，并在室溫下以100-400×g離心細胞5分鐘。通過在室溫下以100-400×g離心5分鐘，用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）清洗細胞。吸出PBS并以1.0×10 7個細胞/ mL的最終密度將細胞沉淀重懸于Resuspension Buffer R中。 輕輕移液細胞以獲得單細胞懸浮液。避免在室溫下儲存細胞懸浮液超過15-30分鐘，從而降低細胞存活力和轉(zhuǎn)染效率。 可以調(diào)整重懸細胞密度以適應(yīng)電穿孔方案（第18頁）或優(yōu)化方案（第24-29頁）的推薦細胞數(shù)。6. 通過用含有血清和補充劑的0.5mL培養(yǎng)基將孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮濕的37

7、/ 5CO 2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)板。 如果您使用其他培養(yǎng)板，請參見第18頁電鍍介質(zhì)卷建議。7. 對于每個電穿孔樣品，下面列出了每孔的質(zhì)粒DNA或siRNA的推薦量，細胞數(shù)量和電鍍培養(yǎng)基的體積。 使用再懸浮緩沖液T作為初級懸浮液8. 使用3 mL電解緩沖液（使用緩沖液E，10LNeon®Tip和緩沖液E2，100LNeon®Tip）裝入Neon®移液管9. 根據(jù)您的單元格類型在設(shè)備上設(shè)置所需的脈沖條件10. 將適量的質(zhì)粒DNA / siRNA轉(zhuǎn)移到無菌的1.5mL微量離心管中。11. 將細胞加入到含有質(zhì)粒DNA / siRNA的管中，輕輕混合。 請參見上表，了解細胞濃度

8、，DNA和電鍍量。12. 要將Neon®Tip插入Neon®移液器，請將移液器上的按鈕按到第二個停止位置以打開夾具13. 將Neon®移液器的頂部插入Neon®Tip，直到夾具完全拿起活塞的安裝桿（見下圖）14. 輕輕釋放按鈕，繼續(xù)向移液器施加向下的壓力，確保尖端密封在移液管上，沒有間隙。 注意：確保Neon®移液器和尖端緊密連接，無間隙（見左圖），無故障移液和正確的電氣連接15. 將Neon®移液器上的按鈕按到第一站，并將Neon®Tip浸入細胞DNA / siRNA混合物中。 緩慢釋放移液器上的按鈕，將細胞DNA / s

9、iRNA混合物吸入Neon®Tip。在移液過程中避免氣泡，因為氣泡在電穿孔期間導(dǎo)致電弧，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染降低或失敗。 如果您注意到尖端中有氣泡，請丟棄樣品，并小心地將新鮮樣品再次吸入尖端，無任何氣泡。16. 將帶有樣品的Neon®移液器垂直插入放置在Neon®移液器站中的Neon®Tube，直至聽到咔嗒聲。 確保移液器突起插入吸液管的槽中。17. 確保Neon®移液器的金屬頭與Neon®移液器支架內(nèi)的球形活塞和Neon®Tube（見左圖所示的正確位置）緊密連接。18. 在傳送電脈沖之前，Neon®設(shè)備會自動檢查Neon&#

10、174;Tube和Neon®Pipette是否正確插入。19. 在電穿孔期間監(jiān)測Neon®Tip，以查看是否有由于尖端存在氣泡引起的電?。ɑ鸹ǎ?。 電弧導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低，細胞活力低。20. 交付電脈沖后，觸摸屏上將顯示“Complete”以指示電穿孔完成。21. 從Neon®移液器站慢慢移除Neon®移液器，并立即從Neon®Tip中將樣品從移液器上按下第一個停留點，放入含有預(yù)熱培養(yǎng)基的準(zhǔn)備培養(yǎng)基中。22. 我們強烈建議將電穿孔細胞加載到?jīng)]有抗生素的生長培養(yǎng)基中，這可以大大降低轉(zhuǎn)染后細胞的活力。23. 要放棄Neon®Tip，請按第二個

11、按鈕的按鈕進入適當(dāng)?shù)纳镂ｋU廢物容器。24. 對剩余的樣品重復(fù)步驟7-16。 使用兩次后，請務(wù)必更換Neon®Tips，并在10次使用后更換Neon®Tubes。 每個新的質(zhì)粒DNA樣品使用新的Neon®Tip和Neon®Tube25. 輕輕搖動板，以確保細胞的均勻分布。 在37下在加濕的CO2培養(yǎng)箱中孵育該板。注意1.如果您沒有使用Neon®設(shè)備，將后面的電源開關(guān)轉(zhuǎn)到OFF位置。2. 避免在Neon®移液器臺內(nèi)溢出任何液體，以防止移液器臺上的球塞上產(chǎn)生銹跡。3. 如果您不小心將任何液體（如緩沖液，水，咖啡）濺入Neon®移

12、液器站內(nèi)，請將主機從主設(shè)備上斷開，并用干燥的實驗室紙擦拭。倒置并允許車站在室溫下完全干燥24小時。優(yōu)化流程1. 確保您按照第16-17頁所述制備細胞，使用DNA或siRNA，并制備含有0.5 mL含有血清和無抗生素的培養(yǎng)基的24孔板，以轉(zhuǎn)移電穿孔細胞。 準(zhǔn)備足夠的細胞和質(zhì)粒DNA / siRNA進行至少30次轉(zhuǎn)染。2. 對于使用24孔格式的10LNeon®Tip的每個電穿孔樣品，請參見下表。 對于以24孔格式使用100LNeon®Tip，請將下表中列出的數(shù)值適當(dāng)調(diào)整10倍。3. 使用3 mL電解緩沖液（將緩沖液E用于10LNeon®Tip和緩沖液E2，100LNeon®Tip）置于含有細胞DNA / siRNA混合物的Neon®移液站中，如第15頁所述。4. 按優(yōu)化和加載優(yōu)化協(xié)議開始電穿孔使用下