淺論表面修飾對氧化鐵納米粒子類酶活性的影響

1、淺論表面修飾對氧化鐵納米粒子類酶活性的影響                    作者：楊婷,吳沂航,張曉慶,張宇,顧寧【摘要】  目的：研究表面修飾對氧化鐵納米粒子類酶活性的影響。方法：用共沉淀法制備Fe2O3納米粒子，并用透射電子顯微鏡（TEM）表征。將Fe2O3納米粒子分別表面修飾二巰基丁二酸（DMSA）、檸檬酸、酒石酸和3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）,并用Zeta電位儀表征。由于Fe2O3納米粒子可以催化雙

2、氧水氧化底物3,3,5,5四甲基聯(lián)苯胺（TMB），從而發(fā)生顯色反應(yīng)，這一特性與辣根過氧化物酶（HRP）相似，通過島津UV3600紫外可見分光光度計和酶標(biāo)儀檢測該顯色反應(yīng)，評估氧化鐵納米粒子的催化性能及表面修飾的影響。結(jié)果：（1） TEM和Zeta電位測量表明，F(xiàn)e2O3納米粒子直徑約為13 nm，表面修飾能夠有效調(diào)控其表面電荷；（2） 氧化鐵納米粒子類過氧化物酶催化活性與納米粒子的表面電荷相關(guān)，表面負(fù)電荷有利于增加對帶正電荷底物TMB的親和力，從而增加類酶活性；（3） Fe2O3/DMSA具有最高的表面負(fù)電荷，米氏常數(shù)測量表明Km（TMB）為0.3 mmol·L-1，表現(xiàn)出與天然HR

3、P對底物TMB類似的親和力。結(jié)論：通過表面修飾可以調(diào)控氧化鐵納米粒子的類酶活性，其作為HRP模擬酶具有潛在的應(yīng)用價值。 【關(guān)鍵詞】  氧化鐵納米粒子； 表面修飾； 辣根過氧化物模擬酶Abstract Objective:To investigate the effect of surface modifications on the peroxidaselike activity of iron oxide nanoparticles.Methods:Magnetic iron oxide nanoparticles were prepared by coprecipitation

4、method.The morphology of particles was observed by using TEM.The obtained Fe2O3 nanoparticles were modified with meso2,3Dimercaptosuccinic acid（DMSA）,citric acid,tartaric acid and 3aminopropyltriethoxysilanes(APTS),respectively,and the resultant products were characterized by zeta potential measurem

5、ents.Like horseradish peroxidase（HRP）,Fe2O3 nanoparticles were found to be able to catalyze a colour reaction of the substrate 3,3,5,5tetramethylbenzidine(TMB) in the presence of H2O2.The catalysis was evaluated by detecting the colour reaction using UVvisible spectrophotometer and microplat reader.

6、Results:(1) TEM measurements showed that the mean diameter of Fe2O3 nanoparticles was 13 nm.(2) The peroxidaselike activity of Fe2O3 nanoparticles was found to be related to their surface charge.TMB carries two amine groups,likely yielding stronger affinity toward a negatively charged nanoparticle s

7、urfaces.（3）Fe2O3/DMSA nanoparticles with the strongest negative surface charge exhibited the highest peroxidaselike activity than others when TMB acts as a substrate.The kinetic parameter of Fe2O3/DMSA nanoparticles were determined to be Km（TMB）=0.3 mmol·L-1,exhibiting a similar enzyme activity

8、 to the natural HRP.Conclusions:The peroxidaselike activity of Fe2O3 nanoparticles can be readily regulated by surface modifications,thus providing a potential advantage for application as a HRP mimic enzyme.Key words iron oxide nanoparticles; surface modification; HRP mimic enzyme   磁性氧化鐵

9、納米粒子因其具有多種獨(dú)特的功能，在生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。同一種磁性氧化鐵納米材料可以作為磁共振成像對比劑1-3、磁靶向藥物載體4，可以用于細(xì)胞與生物分子分離5、生物傳感與檢測6，還可以作為磁感應(yīng)腫瘤熱療的磁介質(zhì)7。另外，在工業(yè)廢水處理方面，磁性氧化鐵納米粒子因具有較高的有機(jī)物羥基化的活性而用于苯酚等有毒物質(zhì)的清除（苯酚等有機(jī)物羥基化后毒性降低）8。在氧化鐵磁性納米粒子的應(yīng)用方面，一個體系內(nèi)同時發(fā)揮其多種功能的研究，是目前更具有發(fā)展前景的工作。   過氧化物酶是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類氧化還原酶,通過其內(nèi)部的變價鐵元素以及外部結(jié)構(gòu)能催化H2O2氧化氫供體底物。

10、在生命活動過程中,過氧化物酶主要是催化生物體內(nèi)的氧化物或過氧化物氧化分解其他毒素。目前廣泛應(yīng)用的過氧化物酶是從天然植物中提取的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。HRP價格昂貴,且保存及實(shí)驗(yàn)條件苛刻，容易失活,在酶聯(lián)免疫分析上因其分子較大而不利于抗原抗體結(jié)合,并且標(biāo)記過程復(fù)雜。因此,尋找能夠替代HRP的模擬酶是酶催化反應(yīng)的熱點(diǎn)9-10。   在眾多酶模擬物中，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子最近被發(fā)現(xiàn)能像Fenton試劑一樣，表現(xiàn)出一定的類過氧化物酶活性，由此結(jié)合磁分離功能，能夠發(fā)展可同時進(jìn)行磁分離富集和免疫檢測的方法11。由于Fe3O4納米粒子穩(wěn)定

11、性好、制備方法簡單、成本低、易于大規(guī)模制備，同時還兼具有磁性等其他多功能特性，因此在醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值。Fe2O3是另外一種磁性較強(qiáng)的氧化鐵納米粒子，可由Fe3O4納米粒子直接氧化而來。由于Fe2O3磁性納米粒子中只含有三價鐵，因此，相對于Fe3O4納米粒子來說不易被氧化，具有良好磁學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性。但是由于Fe2O3磁性納米粒子中缺乏二價鐵，其本身類酶活性大大降低，從而嚴(yán)重限制了其作為模擬酶的應(yīng)用。作者通過表面修飾，提高Fe2O3磁性納米粒子類酶活性，從而得到一類穩(wěn)定的、具有過氧化物酶活性的磁性Fe2O3納米粒子。   1  材料與方法

12、1.1  主要試劑   3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）及3,3,5,5四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自SigmaAldrich公司（美國）。30%H2O2、醋酸鈉及冰醋酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、二巰基丁二酸（DMSA）、檸檬酸及酒石酸購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。   1.2  實(shí)驗(yàn)方法Fe2O3磁性納米粒子的制備及表面有機(jī)小分子修飾采用我們先前報道12-13的方法。（1） Fe2O3磁性納米粒子的制備12。在N2保護(hù)下制備Fe3+（FeCl3·6H2O,0.

13、2 mol·L-1）和Fe2+（FeSO4·7H2O，0.13 mol·L-1）的混合溶液800 ml，將2.8 mol·L-1的氨水在劇烈的磁力攪拌下緩慢加入其中，直至pH=9，反應(yīng)1 h，生成黑色沉淀，將生成物用永磁鐵分離出來，反復(fù)用去離子洗滌4遍。將制備得到的Fe3O4產(chǎn)物定容到6 L，用HCl（0.2 mol·L-1）調(diào)節(jié)溶液pH值到3.0，待pH值穩(wěn)定后水浴升溫到90 ，鼓入過濾的空氣進(jìn)行氧化（90 min），從而得到Fe2O3納米粒子。通過磁分離方法反復(fù)洗滌4遍后，定容約1 g·L-1，調(diào)pH=2.7。（2） Fe2O3/

14、DMSA磁性納米粒子的制備12。稱取60.69 mg DMSA，用DMSO溶解，機(jī)械攪拌下加入到400 ml Fe2O3磁性納米粒子樣品中，繼續(xù)攪拌5 h，停止反應(yīng)，磁分離洗滌沉淀物3次，加80 ml去離子水定容，用四甲基氫氧化銨調(diào)pH=6.5。（3） Fe2O3/檸檬酸磁性納米粒子的制備13。稱取52.6 mg檸檬酸，用10 ml去離子水溶解，機(jī)械攪拌下加入到400 ml Fe2O3磁性納米粒子樣品中，繼續(xù)攪拌5 h停止反應(yīng)，磁分離洗滌沉淀物3次，加80 ml去離子水定容，用四甲基氫氧化銨調(diào)pH=6.5。（4） Fe2O3/酒石酸磁性納米粒子的制備13。取37.6 mg酒石酸，用10 ml去

15、離子水溶解，機(jī)械攪拌下加入到400 ml Fe2O3磁性納米粒子樣品中，繼續(xù)攪拌5 h停止反應(yīng)，磁分離洗滌沉淀物3次，加80 ml去離子水定容，用四甲基氫氧化銨調(diào)pH=6.5。（5） Fe2O3/APTS磁性納米粒子的制備12。取800 ml Fe2O3磁性納米粒子樣品，用無水乙醇磁分離洗滌3次，定容至600 ml，充分超聲。之后機(jī)械攪拌下在該反應(yīng)體系中加入0.5 ml APTS，半小時后加去離子水100 l，繼續(xù)攪拌3.5 h。停止反應(yīng)后用無水乙醇磁分離洗滌沉淀物3遍，去離子水洗滌3遍，定容到160 ml，鹽酸調(diào)pH=3.85。（1） 原子吸收測定Fe濃度：上述5個樣品各取100 l，分別加

16、1 ml濃鹽酸靜置12 h，充分反應(yīng)將氧化鐵納米粒子溶解為鐵離子，再用去離子水定容至10 ml，待測。儀器型號為18080（日本Hitachi公司）。最終樣品統(tǒng)一定濃度為2.3 g·L-1。（2） 透射電鏡（TEM）表征：將Fe2O3樣品用去離子水稀釋后，滴1滴于TEM專用銅網(wǎng)上，40 下真空烘干8 h，待測。儀器型號為JEM200EX。（3） Zeta電位儀表征不同小分子對Fe2O3納米粒子的修飾情況：將上述5個樣品去離子水充分洗滌除去溶液中電解質(zhì)，定容后待測。儀器型號為ZetaMaster3000。   1.3  小分子配體修飾的Fe2O3納米粒子的

17、類過氧化物酶催化性能研究各個反應(yīng)體系中，在石英比色皿內(nèi)，分別取34 g磁性納米粒子，溶于1 ml醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）中，加入50 l TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO）和160  l的30%H2O2。用島津UV3600紫外可見分光光度計測得顯色反應(yīng)10 min后的吸收光譜圖。在各個反應(yīng)體系中，分別取6.77 g不同有機(jī)分子修飾的Fe2O3磁性納米粒子，溶于200 l醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）中，加入10 l TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO）和32 l的30%H2O2。在BIORAD 680酶標(biāo)儀檢測650 nm下的光吸收

18、值，掃描時間為1 200 s，反應(yīng)溫度為25 。（1） TMB的米氏常數(shù)測定。取6.77 g  Fe2O3/DMSA磁性納米粒子，溶于200 l醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.6）中，加入13 l的30%H2O2，分別加入不同量（0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 l）的TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO），BIORAD 680酶標(biāo)儀檢測650 nm下的光吸收值，掃描時間120 s，反應(yīng)溫度25 。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取數(shù)據(jù)。（2） H2O2的米氏常數(shù)測定。取6.77 g  Fe2O3/DMSA磁性納米粒子，溶于200 l醋酸鈉緩沖溶液（pH4.

19、6）中，加入5 l TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO），分別加入不同量（0.7、1.3、2.6、5.2、7.8、10.4、13.0 l）的30%H2O2，在BIORAD 680酶標(biāo)儀檢測650 nm下的光吸收值隨時間變化，反應(yīng)溫度25 。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取數(shù)據(jù)。         2  結(jié)果與討論   圖1（A）是Fe2O3納米粒子的TEM照片，圖1（B）是由圖1（A）統(tǒng)計出的Fe2O3納米粒子的粒徑分布。從圖1中可以看出Fe2O3納米粒子接近球形，平均粒子直徑為13

20、 nm。   通常納米粒子表面的修飾，可以達(dá)到以下目的：(1) 改善或改變納米粒子的分散性；(2) 提高粒子表面活性；(3) 使粒子表面產(chǎn)生新的物理、化學(xué)、機(jī)械性能及新的功能；(4) 改善納米粒子與其他物質(zhì)之間的相容性。對氧化鐵納米粒子進(jìn)行表面修飾可以增加其性能14。   為了對比配體修飾對Fe2O3納米粒子催化活性的影響，我們分別用DMSA、檸檬酸、酒石酸及APTS對Fe2O3納米粒子進(jìn)行表面修飾，各小分子結(jié)構(gòu)式見圖2（A），結(jié)合圖2（B）可知，修飾后氧化鐵納米粒子的表面電荷從負(fù)到正順序?yàn)镕e2O3/DMSA的平均表二巰基丁二酸修飾的Fe2O3納米粒子

21、（Fe2O3/DMSA）具有最高的表面負(fù)電荷是由于表面修飾過程中分子間形成了二硫鍵，導(dǎo)致二巰基丁二酸會以幾聚體的形式化學(xué)吸附（通常是羧基或巰基與粒子表面鐵原子形成配位鍵）到粒子表面，提供了  1吳媛，吳國球，劉乃豐，等.結(jié)締組織生長因子單克隆抗體超微超順磁氧化鐵粒子的制備及其生物活性的研究J.東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，28(4):321324.2曹燁,吳小濤,王運(yùn)濤,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤及其修復(fù)椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究J.東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2009,28(4):269273.3CLOULY C,POULINQUEN D,LUCET I,et al.Developmen

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