紫外分光光度計測蛋白質(zhì)含量

1、紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量1 儀器與試劑TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管，吸量管標準蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液2 實驗方法與原理 本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280nm

2、附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點。3 實驗步驟3.1 準備工作3.3.1啟動計算機，打開主機電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。 3.3.2 在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選擇光度測量，設(shè)置測量條件（測量波長等）。 3.3.3 將空白放入測量池中，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零。3.3.4 標準曲線的制作。 3.2 測量工作 3.2.1吸收曲線的繪制 用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標準蛋白

3、質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm400nm區(qū)間，q全波段掃描。 3.2.2標準曲線的制作 用吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5mL 5.00 mg.mL-1標準蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度A278記錄所得讀數(shù)。 3.2.3樣品測定 取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液3mL，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平行測定三份。4 實驗結(jié)

4、果記錄4.1 吸收曲線根據(jù)全波段掃描結(jié)果，已知蛋白質(zhì)的最大吸收峰位于280nm左右。（max=278nm）4.2 標準曲線的制作 以蛋白質(zhì)標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。標準溶液濃度C(mg/mL)吸光度A0.250.1750.500.3380.750.5381.000.6981.250.892繪制的蛋白質(zhì)標準曲線如下圖所示。4.3 測定結(jié)果根據(jù)兩次平行測定的結(jié)果，得出未知蛋白溶液吸光度、根據(jù)標準曲線算出的蛋白溶液含量如下表所示。平行測定次數(shù)樣品液吸光度A樣品溶液濃度C(mg/mL)10.36440.51820.36600.520所測溶液平均濃度: C=0.519(mg/mL

5、) 5 實驗討論本次實驗采用的蛋白溶液為牛血清蛋白。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在 275280 nm 處具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，符合朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 的光吸收值不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為 1.0 mg/mL 的 1800 種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280 nm的吸光度在 0.33.0 之間，平均值為1.25±0.51。1上圖為文獻1中以0.9%NaCl溶液為參比液，將濃度為0

6、.3mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，進行波長掃描測量，得到吸收曲線。從吸收曲線可得 0.3 mg/mL 標準蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長為279 nm，此波長下的吸光度為 0.167。根據(jù)文獻顯示，儀器誤差、不適當?shù)男是€、測量中不符合朗伯比爾定律的光學、化學因素、顯色反應(yīng)條件、共存離子干擾以及儀器測試條件等都是影響分光光度計準確性的因素。2最讓我印象深的便是儀器誤差，主要體現(xiàn)在樣品池的使用上。一般來說，為得到最準確的定量結(jié)果,應(yīng)使用同一樣品池測量標準樣品和待測樣品，雖然這樣比較麻煩，根據(jù)文獻2我們知道，最好的樣口池應(yīng)有平整、嚴格平行的光學表面,否則會使光束偏離,引起表觀吸光度誤差;另外，樣品池在樣品架

7、上的方位應(yīng)始終不變,這樣不致于使測量空白和樣品時的光學效應(yīng)不一致而產(chǎn)生誤差。因此我認為，今后在使用分光光度計的時候，若要平行測定樣品，應(yīng)該使用同一樣品池來裝樣品，不要像以往一樣，因為麻煩、圖快，就使用幾個不同的樣品池來測定，另外，師姐一再強調(diào)樣品池在裝不同樣品之前一定要用去離子水、樣液潤洗幾遍，保證不會有上一樣品的殘留，并且將光面上的殘留物擦干，不能留有指紋，否則都會影響測定的準確性。另外，在繪制標準曲線的時候也有一定的講究，根據(jù)文獻我們知道3，理論上僅用一個已知濃度的標準物質(zhì)測量其吸光度便可進行定量分析校正,測得的吸光度值除以濃度便得斜率。但是有很多儀器和樣品因素會偏離朗伯-比耳定律。若校準工作曲線不準確,會造成定量分析結(jié)果較大的誤差。因此要得到一條標準工作曲線,應(yīng)測量至少三個已知濃度標準樣品溶液的吸光度,標準樣品的濃度范圍應(yīng)包括待測樣濃度。然后用線性回歸方法找到所測數(shù)據(jù)和校正曲線的最佳擬合,以決定哪種類型的工作曲線可給出最佳的擬合。我認為在平時的實驗當中，我們的待測樣濃度經(jīng)常沒有在標準樣品的濃度范圍內(nèi)，若樣品濃度不在此范圍內(nèi)，可能會導致線性關(guān)系不佳，造成實驗誤差，而本次實驗的標準曲線很好，待測樣品濃度落在標準樣品范圍內(nèi)。參 考