ConA激活的小鼠T細(xì)胞CD69表達(dá)動(dòng)力學(xué)的體內(nèi)外研究

1、    ConA激活的小鼠T細(xì)胞CD69表達(dá)動(dòng)力學(xué)的體內(nèi)外研究        摘要目的為明確CD69體內(nèi)外表 達(dá)動(dòng)力學(xué)并進(jìn)一步探討其作用。方法ConA體內(nèi)外 刺激小鼠T細(xì)胞后，選取不同時(shí)間點(diǎn)，流式細(xì)胞儀觀察T細(xì)胞CD69表達(dá)率。結(jié)果ConA刺激后2h CD69即有明顯表達(dá)，68h達(dá)到峰值；CD8與CD8T細(xì)胞相比無(wú)明顯差異；體外條件對(duì)CD69的表達(dá) 有顯著的影響。結(jié)論結(jié)果提示CD8和CD8+T細(xì)胞的活化均需要CD69的參與；T細(xì)胞可能在活化早期一過(guò)性高表達(dá)CD69；CD69很

2、可能是一個(gè)T細(xì)胞增殖的共刺激信號(hào)。關(guān)鍵詞T細(xì)胞活化；CD69；動(dòng)力學(xué)中分類(lèi)號(hào)R392.12文 獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-8861（2000）03-0210-04 Dynamics of CD69 expression on ConA acti vated mice T lymphocytes in v   itro and in vivoZHANG Lei，MIN Zhi-lian（Department of Urology，Changz heng Hospital，Shanghai 200003，China）GE Qi，ZENG Yao-ying（N ational P

3、rofessional Laboratory of Tissu e Transplantation and Immunology，Jinan U niversity ，Gunangzhu 510632，China）SUN Er-wei（Dep artment of Kidney Transplantation，Zhujia ng Hospital，Guangzhou 510282，China）AbstractObjective In orde r investigated the dynamics of CD69 expr ession on ConA stimulated T lymphoc

4、ytes   in vitro and in vivo.MethodsThe CD69 expression were observed by cytometry at selected time points after ConA stimulation in vitro and in vivo.ResultsThe expression  of  CD69 started to express within 2 hours of stimulation and reached its clima x 68 hours later.There were no s

5、ignific ant differ ences of expression between CD8 and CD 8 subsets.The culture conditions had obvious influence on CD69.ConclusionsCD69，which may transiently express on T cell at its early stage  of activation，is a promising candidate of T lymphocyte co-stimulators that is re quired in the act

6、ivation of both CD8 and CD8 subsetsKey wordsT lymphocyte；act ivation；CD69T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的核心，其活化過(guò)程一直是免疫學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。T細(xì)胞活化 產(chǎn)生各種改變：有生化學(xué)的改變，如磷脂酰肌醇的代謝以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高；還可引發(fā)一 些特殊基因的表達(dá)。T細(xì)胞活化后表達(dá)數(shù)個(gè)膜表面分子，CD69是其中表達(dá)最早的一個(gè)，刺激后12h即可在T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)CD69。CD69早期被稱(chēng)為AIM（activ ation inducer molecule），EA-1，Leu-23和MLR3，是由兩個(gè)相同的單體經(jīng)不同的糖基化后構(gòu)成的細(xì)胞表面

7、雙體蛋白，分子量60kDa，屬 于C型選擇素受體家族1。T細(xì)胞表面CD69與其單克隆抗體的結(jié)合可引發(fā) 細(xì)胞外Ca的內(nèi)流2；細(xì)胞內(nèi)TNF、IFN-等細(xì)胞因子的分泌 3IL-2及其受體的合成與表達(dá)4，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性5，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)6，增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖。因此它被認(rèn)為是一個(gè)T細(xì) 胞增殖的共刺激信號(hào)1。但CD69的配體至今尚未發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)功能也未確 定6，那么CD69在T細(xì)胞活化的過(guò)程中產(chǎn)生什么作用？在哪個(gè)階段起作用？ 對(duì)T細(xì)胞活化時(shí)CD69的表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究將有助于這些問(wèn)題的解決。T細(xì)胞活化時(shí)CD69的表達(dá)情況，已有數(shù)個(gè)報(bào)道。用以刺激的活化劑有美洲商路7、PHA及PMA8等。這些

8、報(bào)道的資料均有來(lái)源于對(duì)T細(xì)胞的體外研究。 目前，關(guān)于T細(xì)胞CD69表達(dá)尚未見(jiàn)有體內(nèi)研究的資料發(fā)表。那么體外實(shí)驗(yàn)是否會(huì)受到人 工培養(yǎng)環(huán)境的影響，其結(jié)果是否和體內(nèi)的真實(shí)情況相符？本課題比較了ConA的刺激下小 鼠T細(xì)胞CD69表達(dá)的體內(nèi)外動(dòng)力學(xué)變化，以進(jìn)一步探討CD69的作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器1.1.1動(dòng)物：Balbc近交系小鼠，雄性，68周齡，購(gòu)自中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心。1.1.2主要試劑和儀器：刀豆素A（ConA）購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；RPMI 1640和胎牛血清（FCS）購(gòu)自美國(guó)HYCLONE公司；谷氨酰胺（L-Glu）由 美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn)；2巰基乙醇（

9、2-ME）為日本Nacalai公司生產(chǎn)。所用 抗小鼠單克隆抗體見(jiàn)表1。表1本實(shí)驗(yàn)所用抗小鼠單克隆抗體Tab1The monoclone antibodies used in this studySpeciesIsotypeClonePNCompanyCD3-PERATIgG2AHT3IM2769IMMUNOTECHCD8-Cy-ChromeRATIgG2A,k53-6,701504DPHARMINGENCD69-FITCHAMSTERIgG,group 1，H1,2F301048APHARMINGEN二氧化碳孵箱為Shel-lab（美國(guó)）產(chǎn)品，高速低溫離心機(jī)由Universal（美國(guó)）出品，激

10、光流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司FACStarplus型。1.2方法1.2.1ConA刺激的小鼠T淋巴細(xì)胞CD69表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究體外實(shí)驗(yàn)：無(wú)菌條件下取6只Balbc小鼠的脾臟，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各3只。碾磨后細(xì)胞懸于RPMI1640培養(yǎng)液（含20胎牛血清），100目尼龍網(wǎng)濾過(guò)。取少量細(xì)胞懸液，0.4臺(tái)盼藍(lán)侵染檢查細(xì)胞活率（98），3 乙酸溶液稀釋后細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)至106ml后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組加入ConA溶液（1mgml，20l）終濃度10gml，對(duì)照組加入等量PBS。將細(xì)胞置于37°C，5CO2孵箱內(nèi)孵育。2，4，6和20h后 分別取樣，PBS洗1次，標(biāo)記熒光抗體，流式細(xì)胞

11、儀檢測(cè)T細(xì)胞CD69陽(yáng)性率。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：3只Balbc小鼠尾靜脈注射ConA-PBS溶液（濃度1mgml，10gg體重）（實(shí)驗(yàn)組），或等體積PBS溶液（對(duì)照組）。于注射后0，4，8和24h分別于尾靜脈取血30l。標(biāo)記熒光抗體后，流式細(xì)胞 儀檢測(cè)T細(xì)胞CD69陽(yáng)性率。1.2.2淋巴細(xì)胞熒光抗體標(biāo)記：三色直接熒光標(biāo)記法：體外實(shí)驗(yàn)所收集的樣品中加入適量PBS洗1次，離心后盡可能去盡 上清，加入熒光直標(biāo)抗體anti-CD3-PE，anti-CD8-Cy-Chrome，anti-CD69-FITC各10l，輕輕混勻，避光，室溫孵育30min，PBS洗1次，1多聚甲醛PBS固定10min后流式細(xì)胞儀待測(cè)。體

12、內(nèi)實(shí)驗(yàn)的血標(biāo)本直接標(biāo)記抗體之后，用紅細(xì)胞裂解液溶血，PBS洗1次，固定，待測(cè)。1.2.3流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)獲取及分析：全部數(shù)據(jù)用流式細(xì)胞儀和軟件LYSYS 進(jìn)行三色熒光參數(shù)獲取及分析。簡(jiǎn)述如下：在前散射（FSC）和側(cè)散射（SSC）的二維Dot-plot中，劃出淋巴細(xì)胞區(qū)（R1），然后對(duì)淋巴細(xì)胞作PE、FITC和Cy-Chrome熒光強(qiáng)度檢測(cè)，其中熒光1（FL1）為FITC，濾光片帶通為530± 10nm，熒光2（FL2）為PE，濾光片帶通為575±10nm，熒光3.1（FL3.1）為Cy-Chrome，濾光片帶通為660±10nm。先根據(jù)淋巴細(xì)胞PE熒光強(qiáng)度劃出CD3

13、T細(xì)胞區(qū)（R2），再檢測(cè)T細(xì)胞FITC和Cy-Chrome熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)顯示于雙色Dot-plot（FL1 vs FL3.1）中。 數(shù)據(jù)分析時(shí)，根據(jù)Isotype的非特異性熒光強(qiáng)度設(shè)定界限，以確定雙陽(yáng)性、雙陰性和單陽(yáng)性區(qū)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)均由SPSS7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1體外實(shí)驗(yàn)ConA刺激前，小鼠CD3T細(xì)胞表面CD 69弱表達(dá)（9.33±2.69）。ConA刺激2h后，既可觀察到CD69表達(dá)開(kāi)始增多（23.9±11.7），6h達(dá)到峰值（83.9±2.7），20h 出現(xiàn)減弱趨勢(shì)（76.6±10.3）。這與文獻(xiàn)8報(bào)道的PMA刺激下

14、的T細(xì)胞CD69表達(dá)動(dòng)力學(xué)基本一致。CD3T細(xì)胞中的CD8和CD8亞群。CD69表達(dá)無(wú)顯著性差異，表現(xiàn)為本底值的相似（9.3±2.6vs9 .3±2.8），對(duì)ConA的反應(yīng)速度相似（刺激2h的表達(dá)率為29.9±12.4vs21.6±10.1），高峰出現(xiàn)的時(shí)間（6h）和數(shù)值相似（84.3±4.9vs83.8±2.7）以及20h后表現(xiàn)出相似的下降 趨勢(shì)（79.4±10.0 vs 76.5±11.3）（見(jiàn)1）。對(duì)照組CDT69弱表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)率無(wú)顯著性差異。1小鼠T淋巴細(xì)胞體外CD69表達(dá)動(dòng)力學(xué)Fig.1The dy

15、namics of CD69 expression on mouse T lymphoytes in vitro2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有許多相似之處，CD3+T細(xì)胞ConA刺激后CD69表達(dá)高峰的出現(xiàn)時(shí)機(jī)(8h)和峰值相似(81.0%±1.6%)，CD8+T細(xì)胞與CD8-T細(xì)胞CD69表達(dá)無(wú)顯著性差異各時(shí)間點(diǎn)P值均>0.05).同時(shí)，體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)也存在明顯的差異，體內(nèi)T細(xì)胞CD69表達(dá)率的本底值明顯低于體外（2.7%±1.1% vs9.33%±2.69%，P=0.017)；體內(nèi)T細(xì)胞CD69一過(guò)性高表達(dá)之后,下降的速度快、幅度大，24h的T

16、細(xì)胞的CD69表達(dá)率僅為21.4%±0.8%(見(jiàn)2).對(duì)照組CD69弱表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)率無(wú)顯著性差異.2小鼠T淋巴細(xì)胞體內(nèi)CD69表達(dá)動(dòng)力學(xué)Fig.2The dynamics of CD69 expression on mouse T lymphoytes in vivo3討論T細(xì)胞活化是其執(zhí)行功能的前奏和基礎(chǔ)，包含有深刻而廣泛的細(xì)胞內(nèi)變化，一些特殊的基因 在T細(xì)胞活化時(shí)表達(dá)，這些基因可被分為立即表達(dá)（刺激1530min后即可表達(dá)）；早期表達(dá)（刺激后30min至48h）以及晚期表達(dá)（刺激后214d）。其中包括數(shù) 個(gè)膜表面分子的表達(dá)，IL-2受體CD25，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71和CD6

17、9是其中的 代表，這些分子被稱(chēng)為活化標(biāo)志9。CD69是其中表達(dá)最早的分子3。本課題以ConA為刺激劑，體內(nèi)外對(duì)照觀察了T細(xì)胞CD69表達(dá)的動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)果表 明：ConA刺激的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的以PHA、PMA8及美洲商路 7為刺激劑的結(jié)果相似。刺激2h后即可觀察到CD69的明顯表達(dá)，6h達(dá)到 峰值，20h雖已有下降的趨勢(shì)但仍維持在較高的水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)有一定 的相似性，同時(shí)也存在顯著性差異。體內(nèi)T細(xì)胞CD69表達(dá)率的本底值明顯低于體外，這 表明淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)過(guò)程對(duì)T細(xì)胞CD69的表達(dá)產(chǎn)生了影響。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中T細(xì)胞 CD69一過(guò)性高表達(dá)之后迅速、大幅的下降則與以往“C

18、D69在T細(xì) 胞表面穩(wěn)定表達(dá)數(shù)天”3的看法出現(xiàn)了分歧。作者傾向于認(rèn)為刺激后T細(xì)胞CD 69確為一過(guò)性高表達(dá)。對(duì)T細(xì)胞的研究顯示，刺激后CD69的mRNA水平出現(xiàn)迅速而 短暫的增高，3060min即可達(dá)到峰值并在8h恢復(fù)到靜息態(tài)水平10。 一些體內(nèi)迅速降解的細(xì)胞因子和原癌基因的mRNA的3端非翻譯區(qū)存 在一個(gè)AU富含區(qū)，CD69的mRNA也存在這個(gè)序列11。這些資料支持本課題的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。之所以在體外培養(yǎng)環(huán)境中持續(xù)表達(dá)可能是由于刺激 劑的持續(xù)存在，而在體內(nèi)刺激劑則可被代謝清除。事實(shí)是否如此需要進(jìn)一步的研究。本課題的結(jié)果表明：CD8和CD8 T細(xì)胞CD69的表達(dá)無(wú)明顯差異，活化前 幾乎不表達(dá)CD

19、69，受到刺激后可迅速而短暫的表達(dá)CD69。這提示CD8 和CD8 T細(xì)胞的活化均需要CD69的參與，CD69所起的作用很可能是在活 化早期傳遞活化信號(hào)，而細(xì)胞的后期活化過(guò)程則不依賴于CD69的存在。近年來(lái)的免疫學(xué)進(jìn)展顯示：免疫反應(yīng)的早期事件決定T細(xì)胞是否反應(yīng)，產(chǎn)生何種反應(yīng)，其中 共刺激信號(hào)起著決定性的作用。CD69做為一個(gè)新的可能的共刺激信號(hào)，越來(lái)越受到人們 的關(guān)注12，對(duì)該抗原的深入研究必將加深人們對(duì)于T細(xì)胞活化過(guò)程和控制機(jī)制 的認(rèn)識(shí)?；痦?xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39870724，3 9970705）作者簡(jiǎn)介張雷（1973-），男，江蘇南京市人，博士研 究生，主要從事T細(xì)胞活化與耐受

20、的研究。張雷（上海長(zhǎng)征醫(yī)院泌尿外科，上海 200003）閔志廉（上海長(zhǎng)征醫(yī)院泌尿外科，上海 200003）葛琪（暨南大學(xué)組織移植與免疫國(guó)家專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632）曾耀英（暨南大學(xué)組織移植與免疫國(guó)家專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632）孫爾維（廣州珠江醫(yī)院腎移植科，廣東廣州510282）參考文獻(xiàn)1TESTI R，D AMBROSIO D，DE MARIA R，et al.The CD69 recept or：a multipu rpose cellsurface trigger for hematopoit ic cellJ.Immunol Today，1994，15（10）：47 948

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