酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基表

1、酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基-PCR引物設(shè)計(jì)用于限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)來源:easylabs 發(fā)布時(shí)間:2009-11-08 查看次數(shù):12704本文給出了分子克隆中常用限制性內(nèi)切酶的保護(hù)堿基序列,如AccI,A flIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,E coRI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,N siI,PacI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,S peI,SphI,StuI,XbaI,XhoI,XmaI,為什么要添加保護(hù)堿基?在

2、分子克隆實(shí)驗(yàn)中,有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn),用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位點(diǎn)不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開,因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí),人為的在酶切位點(diǎn)序列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列,即保護(hù)堿基,用來提高將來酶切時(shí)的活性。其次,在分子克隆實(shí)驗(yàn)中選擇載體的酶切位點(diǎn)時(shí),相臨的兩個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用,因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。該如何添加保護(hù)堿基?添加保護(hù)堿基時(shí),最關(guān)心的應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù)目,而不是種類。什么樣的酶切位點(diǎn),添加幾個(gè)保護(hù)堿基,是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護(hù)堿基,如果嚴(yán)格點(diǎn),是根據(jù)兩條引物的Tm值

3、和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小,GC%較低,添加時(shí)多加G或C,反之亦反。為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求,NEB采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙酶切順序?qū)?huì)有幫助(比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí),或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時(shí)也很有用。在本表中沒有列出的酶,則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端至少加上6個(gè)保護(hù)堿基,以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法:用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A2 60單位的寡核苷酸。取1µg已標(biāo)記了的寡核苷酸與20單位的內(nèi)切酶,在2 0°C條件下分別反應(yīng)2小時(shí)和20小時(shí)。反應(yīng)緩沖液含70mM Tris-HCl (pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及適量的NaCl或KCl(視酶的具體要求而定。20%的PAGE(7M尿素凝膠電泳分析,經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苷酸作為對(duì)照。若底物有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu),切割效率則可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。 注釋:1.如果要加在序列的5端,就在酶切位點(diǎn)識(shí)別堿基序列(紅色的5端加上相應(yīng)的堿基(黑色,相同如果要在3端加保護(hù)堿基,就在酶切位點(diǎn)識(shí)別堿基