CD8mAb對呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥的影響(1)

1、    CD8mAb對呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥的影響(1)    】 目的： 觀察CD8mAb對呼吸道合胞病毒（RSV）誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥的影響. 方法： Balb/c小鼠50只，隨機(jī)分成5組（n=10）： 磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組；卵白蛋白（OVA）組；OVA/RSV模型組；CD8mAb治療組；IgG2mAb治療對照組. 應(yīng)用OVA腹腔注射致敏、OVA氣道霧化結(jié)合RSV滴鼻激發(fā)復(fù)制小鼠哮喘模型，觀察實(shí)驗(yàn)動物氣道炎癥和氣道反應(yīng)性變化，支氣管肺泡灌洗液（BALF）作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，測定BALF上清中白

2、細(xì)胞介素（IL）4, IL5, 干擾素（IFN）含量并采用三色光流式細(xì)胞分析法檢測氣管旁淋巴結(jié)（PBLN）中CD4 , CD8 T細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN, IL4, IL5表達(dá). 結(jié)果： 與模型組相比，CD8mAb可明顯減輕小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng). CD8mAb治療后BALF中嗜酸性粒細(xì)胞及上清中細(xì)胞因子IFN, IL4, IL5含量明顯減少（P均<0.01），CD8 （IFN , IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比及Tc2/Tc1比值明顯下降（P均<0.01）. PBLN中CD8 （IFN , IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比與BALF中IFN, IL4, IL5含量呈顯

3、著正相關(guān)(分別rs=0.765, P<0.01; rs=0.825, P<0.01; rs=0.893, P<0.01). 結(jié)論： CD8mAb對RSV誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)具有抑制作用，其部分機(jī)制可能與致敏條件下病毒感染引起CD8 T細(xì)胞功能發(fā)生轉(zhuǎn)化，即由產(chǎn)生IFN為特征的細(xì)胞毒CD8 T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IL4, IL5為特征的非細(xì)胞毒CD8 T細(xì)胞有關(guān).    【關(guān)鍵詞】 呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8 T細(xì)胞；CD8單克隆抗體；氣道炎癥    0引言   

4、; 臨床及流行病學(xué)研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重原因1. Osullivan等2在因重度哮喘死亡患者的肺標(biāo)本中檢測到呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）,鼻病毒基因組，并發(fā)現(xiàn)氣管旁有大量CD8 T細(xì)胞浸潤，且CD8 T細(xì)胞表面分子CD25,穿孔素表達(dá)增高，提示重度哮喘患者氣道局部存在CD8 T細(xì)胞數(shù)量和功能的異常. Schwarze等3的研究表明，病毒誘導(dǎo)的哮喘與過敏性哮喘在氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制上有所不同，前者的Th2型炎癥主由CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生和維持，而后者主由CD4 T細(xì)胞產(chǎn)生和維持. 上述研究提示，CD8 T細(xì)胞在呼

5、吸道病毒誘導(dǎo)的哮喘發(fā)作及急性加重中起重作用. 因此，我們采用RSV誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，觀察CD8mAb對哮喘氣道炎癥和氣道反應(yīng)性的影響.    1材料和方法    1.1材料    1.1.1動物、試劑和儀器清潔級雌性Balb/c小鼠50只（中國科學(xué)院上海動物中心），68周齡，體質(zhì)量1720 g. 乙酰膽堿（acetylcholine, ACH）,卵白蛋白（ovalburmin,OVA）（Sigma）; IFN, IL4, IL5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑Kit（Bi

6、osource）; 大鼠抗小鼠CD8a(Ly2) mAb，大鼠抗小鼠IgG2mAb對照抗體（BD PharMingen）;流式細(xì)胞檢測試劑盒包括：刺激劑卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（phorbol myristate acetate, PMA）,離子霉素（Inomycin）, 阻斷劑(brefeldinA,BFA)，大鼠抗小鼠PECy5標(biāo)記CD3， FITC標(biāo)記CD8，PE標(biāo)記IFN, IL4, IL5 mAb及大鼠IgG1陰性對照(Caltag);動物肺功能體描箱，呼吸機(jī)(北京鑫奧成科技有限公司提供)；軟件分析系統(tǒng)（AniRes 2003 for Windows 98/2000/XP），酶標(biāo)儀（Su

7、nrise），真空凍干機(jī)（LABCONCO），F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）.    1.1.2細(xì)胞和病毒RSV Long株A型（南京醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室提供）;人喉癌上皮細(xì)胞（HEp2）（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所惠贈）. HEp2細(xì)胞在含100 mL/L滅活胎牛血清的DMEM中37, 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長滿單層后，RSV接種HEp2細(xì)胞，繼續(xù)在含20 mL/L滅活胎牛血清的DMEM的維持液中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)100%時收獲病毒，并凍存于-80冰箱中，反復(fù)凍融、離心后，留上清備用.

8、參照文獻(xiàn)4的方法采用空斑形成試驗(yàn)測定病毒滴度，取滴度為1.0×106空斑形成單位（PFu/mL）RSV備用.            【關(guān)鍵詞】呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8 T細(xì)胞；CD8單克隆抗體；氣道炎癥【Abstract】 AIM:To evaluate the effect of         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作

9、者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    1.2方法    1.2.1實(shí)驗(yàn)分組和動物模型 Balb/c小鼠50只隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組；卵白蛋白(OVA)組；OVA/RSV模型組；CD8mAb治療組；IgG2mAb治療對照組. 動物分別于第1，14日腹腔注射致敏液0.2 mL（0.8 g/L OVA 0.1 mL和等體積液態(tài)鋁混合），第15日起將小鼠置于透明密閉容器中以10 g/L OVA溶液10 mL霧化吸入，

10、每次20 min，隔日1次，連續(xù)5 wk，并分別于第21, 35, 49日用滴度為1.0×106 PFu/mL的RSV 50 L鼻腔滴入，每日觀察小鼠癥狀，于最后1次RSV滴入4 d后測氣道反應(yīng)性. CD8mAb治療組和IgG2mAb治療對照組分別于RSV應(yīng)用6 h后按1 mg/kg ip CD8mAb和IgG2mAb對照抗體.    1.2.2氣道反應(yīng)性測定小鼠經(jīng)腹腔麻醉、氣管切開后，置密閉體描箱中，吸氣管、呼氣管、測壓管按指示連接，小鼠按頻率90次/min、潮氣量56 mL/kg機(jī)械通氣，調(diào)節(jié)呼氣末壓為-8 cmH2O，記錄經(jīng)肺壓、流速、潮

11、氣容積變化. 氣道反應(yīng)性用ACH激發(fā)后以肺阻力(RL)表示，將ACH分別按濃度（0.5， 1.5， 5.0， 15.0和45.0 g/L）、容積為35 L/次尾靜脈注射激發(fā)，經(jīng)肺壓和潮氣容積曲線回到基線后，將濃度增加3倍，每次應(yīng)用ACH后記錄至少10次峰反應(yīng)的肺變量.    1.2.3肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞分類計(jì)數(shù)以0.5 mL PBS進(jìn)行肺泡灌洗，反復(fù)2次，1200 r/min離心5 min，上清保存在-20冰箱中待測定細(xì)胞因子. 沉淀細(xì)胞用0.5 mLHanks液重懸，取0.1 mL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余沉淀細(xì)胞經(jīng)涂片，瑞氏吉姆莎染色，按細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行

12、分類計(jì)數(shù)(至少計(jì)數(shù)200個細(xì)胞).    1.2.4細(xì)胞因子測定將BALF上清放入真空凍干機(jī)內(nèi)-70凍干后，加入200 L生理鹽水重融，按ELISA試劑說明書檢測其中IFN, IL14, IL5含量.    1.2.5三色光流式細(xì)胞分析取氣管旁淋巴結(jié)(PBLN)34枚，眼科剪仔細(xì)剪碎，經(jīng)300目尼龍膜過篩獲單細(xì)胞懸液，1200 r/min離心5 min, 將沉淀細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105/L，按參考文獻(xiàn)5的方法進(jìn)行流式細(xì)胞檢測.   

13、60;1.2.6肺組織病理學(xué)變化取右肺中葉進(jìn)行乙醇脫水，石蠟包埋連續(xù)切片，常規(guī)蘇木素伊紅（HE）染色觀察大體組織病變和炎癥細(xì)胞浸潤情況.        統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，氣道反應(yīng)性變化采用析因設(shè)計(jì)方差分析，其余指標(biāo)組間比較采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVA），相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.    2結(jié)果    21

14、氣道反應(yīng)性變化當(dāng)ACH分別按5， 15 和45 g/L濃度激發(fā)時，OVA組RL分別為（3.69±0.32），(5.87±0.59)和(12.59±1.84）cmH2o/(mLs);與OVA/RSV模型組（5.12±0.54），(9.28±0.86)和(18.94±2.67）cmH2o/(mLs)比較，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）;與OVA/RSV模型組比較，應(yīng)用CD8mAb后（3.08±0.40），(5.67±0.53) 和(10.86±0.82）cmH2o/(mLs)，氣道反應(yīng)性明顯下

15、降（P均<0.01，圖1）. bP<0.01 vs OVA 組； dP<0.01 vs OVA/RSV模型組. OVA：卵白蛋白； RSV： 呼吸道合胞病毒； ACH: 乙酰膽堿.圖1各組動物氣道反應(yīng)性變化（n=10, x±s）2.2BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及上清細(xì)胞因子表達(dá)與OVA組比較，OVA/RSV模型組嗜酸性粒細(xì)胞及細(xì)胞因子IFN, IL4, IL5明顯升高（P均<0.01）. 應(yīng)用CD8mAb后嗜酸性粒細(xì)胞及細(xì)胞因子IFN, IL4, IL5明顯下降（P均<0.01，表 1）. 表1各組BLAF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)   &#

16、160;2.3PBLN中CD4 , CD8 T細(xì)胞及胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)與OVA組比較，OVA/RSV模型組CD8 （IFN ， IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比及Tc2/Tc1比值明顯升高（P均<0.01）. 應(yīng)用CD8mAb后CD8 （IFN ， IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比、Tc2/Tc1比值下降（P均<0.01，表 2）.表2各組PBLN中CD4 , CD8 T細(xì)胞及胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)變化    2.4肺組織病理學(xué)變化OVA/RSV模型組氣道上皮增厚、破壞，管腔狹窄，有支氣管收縮征象，管壁周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤（圖2A）. CD8mA

17、b治療后氣道上皮增厚，管腔狹窄，管壁周圍炎癥細(xì)胞浸潤較模型組減輕（圖2B）. 治療對照組與模型組比較無明顯變化（圖2C）. OVA組氣道上皮增厚，管壁周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度亦較模型組減輕（圖2D）. PBS組未見明顯病理變化（圖2E）.    2.5相關(guān)性分析經(jīng)Spearman 等級相關(guān)分析, PBLN中CD8 （IFN ， IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比與BALF中IFN, IL4, IL5細(xì)胞因子含量呈顯著正相關(guān)(分別rs=0.765, P<0.01; rs=0.825, P<0.01; rs=0.893, P<0.01).3討論

18、    本研究觀察到，與OVA組比較，OVA/RSV模型組小鼠氣道炎癥、肺阻力（RL）明顯增加，提示OVA致敏后RSV感染可顯著加重哮喘，這與大部分的研究結(jié)果相同6. 采用流式細(xì)胞分析進(jìn)一步檢測PBLN中CD4 （IL4 ， IL5 ， IFN ）,CD8 （IL4 ， IL5 ，A： OVA/RSV模型組； B： CD8mAb治療組； C： LgG2mAb治療對照組； D： OVA組； E： PBS組.圖2各組小鼠肺病理變化HE ×200 IFN ）T細(xì)胞百分比發(fā)現(xiàn)，OVA/RSV模型組CD8 （IFN ， IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比

19、及Tc2/Tc1比值較OVA組明顯升高（P均<0.01），且CD8 （IFN ， IL4 ， IL5 ）T細(xì)胞百分比與BALF中IFN, IL4, IL5細(xì)胞因子含量呈顯著正相關(guān)，提示與OVA致敏性哮喘不同，OVA致敏條件下RSV感染后BALF中IFN, IL4, IL5細(xì)胞因子主來源于CD8T細(xì)胞，即CD8T細(xì)胞，尤其Tc2在呼吸道病毒誘導(dǎo)的哮喘加重中起重作用. 新近研究表明7，外源性IL4能體外誘導(dǎo)CD8T細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子如IL5, IL13，提示在哮喘患者IL4表達(dá)占優(yōu)勢的環(huán)境中，病毒感染可刺激CD8T細(xì)胞合成Th2型細(xì)胞因子，這可能是呼吸道病毒加重哮喘的原因. 

20、   應(yīng)用CD8mAb后，OVA/RSV模型組小鼠氣道反應(yīng)性明顯下降，BALF中IL4, IL5, IFN含量及嗜酸性粒細(xì)胞均顯著下降，氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤亦明顯減輕，提示CD8mAb可顯著抑制RSV感染相關(guān)哮喘的氣道炎癥和AHR. 這可能與致敏條件下在Th2型細(xì)胞因子環(huán)境中，RSV感染引起細(xì)胞毒CD8 T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IL5的非細(xì)胞毒T細(xì)胞，CD8mAb對其的抑制可使Th2型細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞氣道分泌、趨化減少有關(guān). 當(dāng)然，CD8 T細(xì)胞對氣道上皮產(chǎn)生直接破壞以及CD8 T細(xì)胞介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，其中釋放的主堿性蛋白(MBP)能結(jié)合氣道平滑肌M2受體導(dǎo)致

21、M2受體功能下降，促進(jìn)AHR8，CD8mAb對其的抑制效應(yīng)可在保護(hù)氣道上皮、減輕氣道炎癥和AHR中起一定作用.            【關(guān)鍵詞】呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8 T細(xì)胞；CD8單克隆抗體；氣道炎癥【Abstract】 AIM:To evaluate the effect of         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不

22、用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    綜上所述，OVA致敏條件下RSV感染可明顯增加氣道炎癥和氣道反應(yīng)性，其中CD8 T細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化加重Th2型氣道炎癥并導(dǎo)致大量嗜酸性粒細(xì)胞氣道募集可能起重作用. 由于臨床上病毒誘發(fā)的哮喘十分頻繁，且與哮喘的急性加重密切相關(guān)，針對CD8 T細(xì)胞的單克隆抗體治療有可能在減少哮喘的急性發(fā)作，減輕哮喘病情、降低死亡率探索一條新途徑.【參考文獻(xiàn)】    1 Teichtahl H, Buckmaster N, Pertniko

23、vs E. The incidence of respiratory tract infection in adults requiring hospitalization for asthmaJ. Chest, 1997,112(3):591-596.    2 OSullivan S, Cormican L, Faul JL, et al. Activated cytotoxic CD8 T lymphocytes contribute to the pathology of asthma death J. Am J Respir Crit Care Med, 2001,164(4):560-565.    3 Schwarze J, Cieslewicz G, Joetham A, et al. CD8 T cells are essential in the development of respiratory syncytial virusinduced lung eosinophilia and airway hyperresponsivenessJ. J Immunol, 1999,162(7):4207-421