蠶蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色譜法測定

1、蠶蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色譜法測定                   作者：金維維，趙鐘興，劉旭輝，羅貞鈺，張蕾，韋俏娜，廖丹葵 【摘要】   目的建立蠶蛹蛋白氨基酸含量的測定方法。方法采用柱前衍生反相高效液相色譜法。結(jié)果在給定的色譜條件下，18種氨基酸在35 min內(nèi)獲得了較好的分離，在一定濃度范圍內(nèi)，氨基酸的峰面積與濃度的線性相關(guān)系數(shù)在0.990 60.999 8之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.02%5.

2、45%(n=5)。并測定了蠶蛹蛋白中氨基酸的組成和含量。結(jié)論該方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于蠶蛹蛋白中氨基酸含量的測定。 【關(guān)鍵詞】   蠶蛹蛋白; 氨基酸; 高效液相色譜法Abstract：ObjectiveTo establish a method for determination of amino acids in protEins of silk worm. MethodsA reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of amino acids w

3、as described. ResultsThe mixture of 18 kinds of amino acids was characterized by HPLC in 36 min. The response was linear for all amino acids with a correlation coefficient of 0.990 60.999 8, method precisions (n=5) for the different amino acids were between 2.02%5.45% (relative standard deviation, R

4、SD). Using this method, 18 kinds of amino acids in protEIn of silk worm were determined. ConclusionThe method is accurate, reliable and repeatable for the determination of amino acids in proteins of silk worm.Key words：Protein of silk worm; Amino acids; HPLC蠶蛹(Bombyxmori L.)作為藥用在我國有悠久的 歷史 。 現(xiàn)代 研究表明，

5、蠶蛹具有較高的營養(yǎng)價值，其中蠶蛹蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，不僅含有人體所需的8種必需氨基酸，且氨基酸配比均衡性好，國內(nèi)已有廠家將蠶蛹水解制成復(fù)合氨基酸產(chǎn)品1。因此測定蠶蛹氨基酸組成，對以蠶蛹蛋白為原料進(jìn)一步開發(fā)功能產(chǎn)品具有重要的 參考 價值。目前，對氨基酸的測定除采用氨基酸自動分析儀外2，柱前衍生反相高效液相色譜法測定氨基酸的技術(shù)也得到了很大的 發(fā)展 ，且具有快速靈敏、不需專用儀器等優(yōu)點3。高效液相色譜法分析氨基酸時常用的柱前衍生試劑如OPA(鄰苯二甲醛)、DANSYL_Cl(丹磺酰氯)、FMOC(9-芴甲基氯甲酸酯)和PITC(異硫氰酸苯酯)等各有優(yōu)點和缺陷46。其中因為OPA 衍生步驟簡單,

6、反應(yīng)速度快, 剩余試劑不干擾測定, 衍生物可用紫外、熒光或電化學(xué)檢測器檢測，故其應(yīng)用最廣，但由于不能和仲氨酸反應(yīng)，而FMOC 能與仲氨酸反應(yīng)，因此將OPA-FMOC聯(lián)用可克服兩者單獨(dú)使用時的缺點。本實驗以O(shè)PA及FMOC為柱前衍生化試劑，利用二極管陣列(DAD)在同一通道用338 nm 和262 nm 雙波長檢測, 同時檢測樣品中的一級和二級氨基酸，建立了蠶蛹蛋白質(zhì)氨基酸分析的方法。1 儀器與試劑Agilent1100高效液相色譜儀，配四元泵及真空在線脫氣機(jī)，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;CSF-1型超聲波清洗器，上海超聲波儀器廠產(chǎn)品;101AS-2型電熱恒溫干燥箱，上海實驗儀器有限公司產(chǎn)品。1

7、8種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)為進(jìn)口分裝產(chǎn)品;3-巰基丙酸(3-MPA)由Alfa Aesar公司，鄰苯二甲醛，醋酸鈉，三乙胺等為國產(chǎn)分析純，上海國藥試劑有限公司產(chǎn)品;甲醇，乙腈，四氫呋喃為色譜純，天津四友色譜試劑廠產(chǎn)品。 2 方法 2.1 試劑配制流動相A：20 mmol/L 醋酸鈉緩沖液(含0.5%四氫呋喃及0.3三乙胺，pH=10.3)，0.45 m濾膜過濾，備用;流動相B：甲醇;流動相C：乙腈。衍生劑A(OPA試劑)：取270 mg OPA試劑，溶于2ml無水乙醇中，加入100 l 3-巰基丙酸，0.2 mol/L硼酸緩沖液(pH 10.8)定容至50 ml，4避光保

8、存。衍生劑B(FMOC試劑)：取10 mg FMOC試劑，乙腈定容至10ml。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，0.1 mol/L HCl溶解定容至25 ml，搖勻，4保存。2.2 水解 稱取適量經(jīng)一次脫脂的蠶蛹(約含蛋白質(zhì)50 mg)于安瓿瓶中，加入6 mol/L HCl 5 ml ，抽真空封口，于110水解24 h，開口后在真空干燥器中去酸，定容至25ml，冷凍保存。因某些氨基酸如色氨酸、組氨酸等在酸性條件下容易被破壞7，需另取一定量的樣品經(jīng)6 mol/L NaOH于安瓿瓶中真空水解24 h，6 mol/L HCl中和，定容至25 ml，冷凍保存。2.3 衍生分別取20 l氨

9、基酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣品水解液置于2ml的Eppendorf管中，加入70 l的衍生劑A和10 l的衍生劑B，振蕩2 min后，經(jīng)0.22 m過濾膜過濾后進(jìn)樣。2.4 色譜分析條件色譜柱為Agilent Eclipse AAA 氨基酸分析柱(4.6 mm×150 mm，5 m)，DAD二極管陣列檢測器， 132 min檢測波長為338 nm，32 min后檢測波長為262 nm，柱溫為35，按在表1中的條件進(jìn)行梯度洗脫。表1 流動相梯度洗脫程序2.5 樣品的定性與定量 樣品的定性采用保留時間法，即在相同的色譜分析條件下，樣品中氨基酸的色譜峰與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰保留時間相同或者相近，則認(rèn)為樣品

10、中含有此氨基酸。樣品的定量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，即配制一定濃度氨基酸混合溶液，得出各氨基酸與其峰面積之間的線性回歸方程，在同樣的色譜分析條件下，對樣品中的氨基酸進(jìn)行分析，根據(jù)峰面積與線性回歸方程得出樣品中氨基酸的濃度8。 3 結(jié)果 3.1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分析結(jié)果 在流動相(A)中加入適量的四氫呋喃(THF)可顯著改善氨基酸的OPA衍生物在Eclipse AAA柱上的分離效果8。加入三乙胺可顯著改善峰型并減小峰寬，降低實驗誤差，經(jīng)多次實驗確定THF和三乙胺的最佳加入量分別為0.5%和0.03%。 由于OPA衍生一級氨基酸，F(xiàn)MOC衍生二級氨基酸，將18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后按表1的色譜條件

11、進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖1。1-Asp 2-Glu 3-Ser 4-His 5-Gly 6-Thr 7-Ala8-Arg 9-Tyr 10-Cys 11-Val 12-Met 13-Trp14-Phe 15-Ile 16-Leu 17-Lys 18-Pro圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液高效液相色譜圖取不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生和分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，氨基酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其它結(jié)果見表2。18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)5次進(jìn)樣分析，各氨基酸保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%3.0%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%5.4%之間。結(jié)果表明，每種氨基酸進(jìn)樣量在0.040.3g

12、范圍內(nèi)時，其線性相關(guān)系數(shù)在0.990 60.999 8之間，具有良好的線性關(guān)系，由于利用Eclipse AAA 氨基酸專用分析柱分離，與ODS通用色譜柱相比，其分離效果和穩(wěn)定性更好9。表2 氨基酸的保留時間、線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及精密度3.2 樣品分析及結(jié)果在與氨基酸混合標(biāo)樣相同的實驗條件下，進(jìn)行蠶蛹蛋白鹽酸水解液和氫氧化鈉水解液的樣品分析，圖2為酸解蠶蛹蛋白的氨基酸液相色譜圖，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 計算 出蠶蛹蛋白中氨基酸的含量如表3。實驗結(jié)果表明蠶蛹蛋白中的18種氨基酸在其色譜條件下除色氨酸和苯丙氨酸外完全分離。從表3可知蠶蛹蛋白中18種氨基酸的含量都在15 mg/g蛋白質(zhì)以上，品種齊全，

13、8種必需氨基酸纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、賴氨酸占總量的60%，且必需氨基酸和l8種氨基酸的配比的含量均符合聯(lián)合國糧農(nóng)/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)所規(guī)定的理想蛋白質(zhì)模式10。同時蠶蛹蛋白中非極性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和甘氨酸含量占總氨基酸含量的27.5%，芳香氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸含量占總氨基酸含量的13.8 %，這兩類氨基酸組成共占氨基酸總組成的 41.3%。對于以蛋白質(zhì)為原料開發(fā)如降血壓肽等功能食品，若選擇蠶蛹蛋白為原料，就一般 規(guī)律 而言，有可能得到高活性的降血壓肽。表3 蠶蛹蛋白中的氨基酸含量 4 結(jié)論 建立了OPA和FMOC試劑聯(lián)用柱

14、前衍生的高效液相色譜分析方法，在35min內(nèi)18種常見氨基酸可獲得較好的分離。用峰面積定量計算其重復(fù)性和精密度較好。在相同實驗條件下，檢測了蠶蛹蛋白質(zhì)中氨基酸的組成和含量，表明蠶蛹蛋白氨基酸品種齊全，必需氨基酸和l8種氨基酸的配比的含量均符合聯(lián)合國糧農(nóng)/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)所規(guī)定的理想蛋白質(zhì)模式，蠶蛹蛋白中非極性氨基酸和芳香氨基酸含量占氨基酸總組成的 41.3%，可作為開發(fā)功能食品的優(yōu)質(zhì)原料。 【 參考 文獻(xiàn) 】   1 羅貴倫,陳 器.蠶蛹硫酸水解制備復(fù)合氨基酸的研究J. 食品 工業(yè) 科技,2003,24(5):59.2 白紅進(jìn),蔣 卉,馬 玲.維藥刺山柑葉子中微量元素和

15、氨基酸成分的研究J. 時珍國醫(yī)國藥, 2007,18(10): 2406.3 丁永勝,牟世芬. 氨基酸的分析方法及其應(yīng)用進(jìn)展J. 色譜，2004,22(3):210.4 牟德海.OPA柱前衍生反相高效液相色譜法測定氨基酸含量J.色譜,1997,15(4):320.5 Battaglia A, Bertoluzza A, Calbucci F,et al. High-performance liquid chromatographic analysis of physiological amino acids in human brain tumors by pre-column derivatization with phenylisothiocyanateJ. Journal of Chromatography B, 1999, 730:81.6 Kang X J, Xiao J,Huang X,et al. Optimization of dansyl derivatization and chromatogramphic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samplesJ. Clinica Chimica Acta, 2006, 366:352