Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控bcl2成員表達(dá)及抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

1、Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控bcl2成員表達(dá)及抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制         08-05-05 15:44:00     編輯：studa20                作者：馬向濤，余力偉，王杉，張在興，杜如昱，崔志榮【摘要】  目的 轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（Signal transducer

2、s and activators of transcription 3, Stat3）通路受細(xì)胞因子與生長因子的刺激而活化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，探討Stat3反義寡核苷酸誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法 用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)Stat3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡；Western blot檢測Stat3、磷酸化Stat3及凋亡家族成員bcl2、bclxL、Mcl1、Caspase3的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染Stat3反義寡核苷酸后HCT116細(xì)胞增殖受抑制，凋亡細(xì)胞增多，Stat3、pStat3與bcl2家族成員表達(dá)水平下降

3、。結(jié)論 Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性增高可能與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，阻斷Stat3通路可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。 【關(guān)鍵詞】  結(jié)腸癌；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；增殖；凋亡Stat3 Signaling Pathway Regulates the Expression of bcl2 Family Members and Promotes Survival of Human Colon Cancer CellsAbstract：Objective  Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) is activated

4、in response to cytokines and growth factors stimulation, and activation of Stat3 is involved in modulating cell proliferation, differentiation and apoptosis. The purpose of the study was to examine colon cancer cell lines to determine whether Stat3 plays an important role in the process of apoptosis

5、 in colon cancer cells. Methods  Protein lysates were extracted from colon cancer cells. Human colon cancer cell line HCT116 was transfected with Stat3 antisense oligonucleotide mediated by liposome, MTT assay was used to measure the proliferation, flow cytometry was applied to analyze the cell

6、 cycle and apoptosis, the expression of Stat3, pStat3, bcl2, bclxL, Mcl1 and Caspase3 were measured by western blot. Results  Targeting of Stat3 using antisense oligonucleotide directed against the translation site, resulted in apoptosis and downregulation of Stat3, pStat3 and bcl2 family membe

7、rs. Conclusion  Constitutive activation of Stat3 is associated with the carcinogenesis of colon cancer cells. Blocking of Stat3 signaling could induce apoptosis of colon cancer cells.Key words：Colon neoplasm；Signal transduction pathway；Proliferation；Apoptosis0  引言    Stat3是轉(zhuǎn)

8、錄信號傳導(dǎo)子與激活子通路（Signal Transducers and Activators of Transcription，STATs）的重要成員，該通路接受生長因子與細(xì)胞因子等細(xì)胞外信號刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡1。目前已發(fā)現(xiàn)Stat3在白血病、胃癌、頭頸部鱗癌及乳腺癌等多種腫瘤組織及細(xì)胞系中呈持續(xù)活化25，但是關(guān)于Stat3在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡過程中的作用還有待進(jìn)一步研究。本研究應(yīng)用Stat3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞，探討Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。1  材料和方法1.1  細(xì)胞培養(yǎng)    結(jié)腸癌細(xì)胞HCT1

9、16由北京大學(xué)人民醫(yī)院外科腫瘤研究室保存，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（美國HyClone公司）的RPMI1640培養(yǎng)基（美國GIBCOL/BRL公司）。1.2  Stat3寡核苷酸的合成與純化    Stat3反義寡核苷酸根據(jù)Stat3翻譯起始點合成，同時本研究還設(shè)立了正義寡核苷酸鏈和錯配寡核苷酸鏈作為對照組，錯配鏈的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，未發(fā)現(xiàn)同源序列。Stat3反義寡核苷酸序列：5CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3；Stat3正義寡核苷酸序列：5AGA AACAGGATGGCCCAATGG 3；Stat3錯配寡核苷酸序列

10、：5 CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3。以上寡核苷酸由美國Santa Cruz公司合成及純化。1.3  陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染    陽離子脂質(zhì)體Lipofect Amine2000（美國GIBCOL/BRL公司），轉(zhuǎn)染過程參照GIBCOL/BRL公司手冊。1.4  細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測（MTT法）    取第36代生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化、分離、收集細(xì)胞、細(xì)胞計數(shù)及測定細(xì)胞活力，活細(xì)胞率達(dá)95%，按每孔4.0×105個細(xì)胞接種于96孔板中，貼壁后，無血清培養(yǎng)細(xì)胞1624h，使細(xì)胞同步化

11、。實驗分為以下4組：（1）空白對照加無血清培養(yǎng)組；（2）正義寡核苷酸組；（3）錯配寡核苷酸組；（4）反義寡核苷酸組，每個研究點設(shè)置3組平行對照，重復(fù)3次實驗取平均值。分別加入脂質(zhì)體及Stat3正義寡核苷酸、錯配寡核苷酸與反義寡核苷酸繼續(xù)培養(yǎng)，濃度分別為0、5、10、20M，第0、24、48、72h分別加入MTT 5mg/ml （美國Sigma公司），繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO 200ml，酶標(biāo)儀測定540nm吸收值，繪制生長曲線，見圖1。1.5  細(xì)胞周期檢測    細(xì)胞同步化后分別加入脂質(zhì)體及Stat3正義寡核苷酸、錯配寡核苷酸與反義寡核苷酸繼續(xù)培

12、養(yǎng)，第0、24、48、72h分別消化細(xì)胞，0.5ml PBS重懸細(xì)胞，70%冰乙醇固定細(xì)胞過夜，加入RNAase A至終濃度50mg/ml，37恒溫水浴1h，加入PI（美國Sigma公司）至終濃度50mg/ml，4避光染色1h，上流式細(xì)胞儀FACScan（美國BectonDickinson公司）檢測，資料用Cell Quest細(xì)胞周期分析軟件處理。1.6  細(xì)胞凋亡檢測    同步化處理及單細(xì)胞懸液制備同前，應(yīng)用凋亡檢測試劑盒，PBS離心洗滌2次，200ml結(jié)合緩沖液重懸，加入ANNEXTIN VFITC至終濃度1mg/ml，加入PI至終濃度2.5mg/

13、ml，室溫避光染色15min，上流式細(xì)胞儀檢測。1.7  Western blot    參照Santa Cruz公司提供的蛋白提取方法，分別裂解結(jié)腸癌細(xì)胞與組織得到總蛋白。以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)蛋白定量試劑盒（美國BioRad公司）手冊繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，于分光光度計595nm下測吸光值，計算出提取液的蛋白濃度。取總蛋白50g，7.5%10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，加入一抗Stat3、pStat3、bcl2、bclxL、Mcl1、Caspase3抗體（美國Santa Cruz公司），工作濃度11000，G

14、APDH 作為內(nèi)參照，辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗，工作濃度11000。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號。1.8  吸光度測定    用PhosphoImager圖像分析儀（美國Molecular Dynamics公司）測定條帶的吸光度（A值），以A值代表蛋白的相對表達(dá)量。1.9  統(tǒng)計學(xué)方法    應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  Stat3反義寡核苷酸可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖    Stat3反義寡核苷酸作用HCT116細(xì)胞72h后，G1期細(xì)胞比率由68.9%上升至85.6%，S期細(xì)胞比率由15.4%下降至7.6%，細(xì)胞增殖受抑制，見圖2。2.2&