卵巢上皮性腫瘤組織整合素β4表達(dá)水平的檢測(cè)

1、卵巢上皮性腫瘤組織整合素4表達(dá)水平的檢測(cè)                   作者：張英 李智敏 莫秋 孫學(xué)剛 【摘要】  目的： 檢測(cè)整合素4在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)水平，分析其作為卵巢腫瘤早期診斷靶標(biāo)的可能性。方法： 取不同病理類(lèi)型卵巢上皮性腫瘤組織，Western blot 檢測(cè)整合素4的表達(dá)水平。結(jié)果： 相對(duì)于正常組織，整合素4在良性卵巢上皮性腫瘤組織中升高的程度較為輕微，在該組織交界性腫瘤中的升高

2、較良性的明顯，在惡性腫瘤中的表達(dá)上調(diào)十分明顯；隨著分化水平的下降，整合素4的表達(dá)相應(yīng)增高；在臨床早期，整合素4的表達(dá)就有所增高，而在有轉(zhuǎn)移的臨床分期中，整合素4的表達(dá)顯著增加。結(jié)論： 整合素4的表達(dá)程度可以作為該類(lèi)惡性腫瘤的早期診斷標(biāo)志物；表達(dá)水平可以作為臨床預(yù)后診斷的分子候選物。 【關(guān)鍵詞】  卵巢腫瘤； 整合素4； 印跡法，蛋白質(zhì)； 細(xì)胞分化； 卵巢上皮性腫瘤   Abstract Objective: To detect the integrin 4 expression in epithelial ovarian tumor, so as to estim

3、ate its value as a target candidate for early diagnosis of the tumor. Methods: Epithelial ovarian tumor tissues of different pathological types were ground separately in ultra low temperature caused by liquid nitrogen，and homogenized with lysis buffer for protein extraction.After running electrophor

4、esis on SDS-PAGE, the extracted protein samples were transferred on PVDF membrane for Western blot to detect integrin 4. Results: Expression of integrin 4 increased slightly, modestly and greatly in benign tumor, borderline tumor and malignant tumor respectively compared with normal tissues. It was

5、discovered that the expression related to differentiation and clinical stages closely. Higher expression of integrin 4 was found in poorly differentiated tumors, or in later clinical stage of the tumor. Even in the early clinical stages, the increase of integrin 4 expression could be detected, and t

6、he expression significantly increased in cases with tumor metastasis. Conclusions: In epithelial ovarian tumor tissue, the expression of integrin 4 relates to the malignancy of the tumor. Since apparent increase of integrin 4 can be found in early stage of the tumor, it is suggested that the protein

7、 can be selected as a marker for early diagnosis.The expression level of integrin 4 closely relates to the differentiation of the tumor,which indicates  that integrin 4 can be used as an index for the prognosis of patients suffered from epithelial ovarian tumor.   Key words ovarian ne

8、oplasms; integrin beta 4; blotting,western; cell differentiation; epithelial ovarian tumor   卵巢腫瘤是女性最常見(jiàn)的腫瘤類(lèi)型之一，惡性卵巢腫瘤的死亡率居?jì)D科腫瘤首位，5年生存率一直徘徊在30%左右。由于卵巢位于盆腔深部，普通檢查難以發(fā)現(xiàn)癌變異常，一般出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，已經(jīng)屬于晚期。至今為止，對(duì)于卵巢腫瘤的早期診斷，尚缺乏有效方法。因此，尋找卵巢腫瘤早期標(biāo)志物、開(kāi)發(fā)相應(yīng)早期診斷方法的工作就顯得尤為重要。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，整合素64（integrin 64，簡(jiǎn)稱(chēng)為整合素4）在鱗癌、乳腺癌

9、、甲狀腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌和胃癌中的表達(dá)水平均明顯增高，而且與腫瘤細(xì)胞的惡性程度相關(guān)1。這些研究結(jié)果提示，整合素4可以作為早期診斷的靶點(diǎn)候選標(biāo)志物。然而，對(duì)于人體卵巢腫瘤組織中的整合素4表達(dá)水平，目前國(guó)際上還缺乏研究數(shù)據(jù)。因此，擬檢測(cè)不同病理類(lèi)型的卵巢上皮性腫瘤組織整合素4的表達(dá)水平，為臨床診斷方法的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。    1  材料和方法   1.1  儀器與試劑    臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Beckman Coulter公司）；Mini VE垂直電泳系統(tǒng)和半干轉(zhuǎn)移儀（GE Health

10、care公司）；Kodak IS2000R圖像工作站（柯達(dá)公司）；Image Station Quantity One 4.4圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司）；-Actin 抗體（Abcam公司）；整合素 4抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗兔IgG和HRP偶聯(lián)的抗鼠IgG（Cell signaling Technology公司）。   1.2  方法   1.2.1  病例選擇  73例病理學(xué)檢查證實(shí)的卵巢上皮性腫瘤組織標(biāo)本取自中山市小欖人民醫(yī)院和南方醫(yī)院婦產(chǎn)科2003-2008年的手術(shù)病例?；颊吣挲g2866歲，平均

11、年齡52歲。其中卵巢上皮性良性腫瘤11例（漿液性囊性瘤6例，粘液性囊腺瘤5例）；卵巢上皮性交界性腫瘤12例（交界性漿液性囊性瘤6例，交界惡性粘液性囊腺瘤6例）；卵巢上皮性惡性腫瘤42例（漿液性囊性癌15例，粘液性囊腺癌12例，卵巢子宮內(nèi)膜樣癌9例，未分化癌6例）；正常卵巢組織8例。惡性腫瘤組織分化程度：高分化8例，中度分化18例，低分化16例。惡性腫瘤的臨床分期：期8例，期16例，期18例。正常卵巢組織取自子宮肌瘤行全子宮加雙側(cè)附件切除術(shù)的患者。全部組織在取材前，病例未經(jīng)化療。   1.2.2  腫瘤組織蛋白質(zhì)樣品的制備  取-80 中凍存的卵巢組織，在

12、液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，添加5倍體積的裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、 1% NP40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS、10% 甘油、137 mmol/L NaCl、1 mmol/LCaCl2、1 mmol/L MgCl2、50 mmol/L NaF、1 mmol/L釩酸鈉，臨用前加入cocktail蛋白酶抑制劑），在冰上反復(fù)研磨至研杵阻力明顯減輕，超聲波裂解，4 12 000 r/min離心20 min，重復(fù)1次，取上清為蛋白質(zhì)提取液。取50 l提取液用Bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。   1.2.3  We

13、stern Blot檢測(cè)整合素  4  為消除組內(nèi)差異，按各病理類(lèi)型進(jìn)行樣品分組，組內(nèi)各例樣品等量混合。Bradford法蛋白定量后，每組取約80 g蛋白樣品，加入5倍上樣緩沖液后進(jìn)行12 SDS-PAGE，將膠上蛋白用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。膜用5的脫脂奶粉室溫封閉1 h，與11 000稀釋的抗4 孵育過(guò)夜，以及HRP偶聯(lián)的相應(yīng)抗（12 000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，然后利用Kodak IS 2 000 R圖像工作站進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。曝光獲取的圖像用Quantity One 4.4進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。每組樣品重復(fù)上樣檢測(cè)5次。   1.2.4&#

14、160; 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法  以條帶灰度值作為蛋白質(zhì)的半定量值，為消除上樣量差異的影響，將各組整合素 4條帶灰度值除以本組-actin條帶灰度值獲得相對(duì)灰度值。用軟件SPSS 16.0進(jìn)行One-way ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析。             2  結(jié)果   2.1  不同病理類(lèi)型的卵巢上皮性腫瘤組織中整合素4的表達(dá)水平   如圖1所示，整合素4在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)水平有所增高。在漿液性囊腺瘤和粘液

15、性囊腺瘤等良性腫瘤組織中，整合素4的表達(dá)水平較正常卵巢組織略有增高；在交界性漿液性囊腺瘤和交界惡性粘液性囊腺瘤等潛在惡性的腫瘤組織中，整合素4表達(dá)量的增高變得明顯，為正常對(duì)照的1.5倍（P0.01）；而在惡性卵巢上皮組織中，整合素4的表達(dá)量為正常對(duì)照的2倍以上（P0.01），尤其是在惡性程度很高的未分化癌中，整合素4的表達(dá)到達(dá)正常對(duì)照的3倍多（P0.01）。相同惡性程度的不同類(lèi)型腫瘤組織中，整合素 4的表達(dá)水平差異不明顯（P0.05）。   2.2  不同分化程度及不同臨床分期的卵巢上皮癌中整合素4的表達(dá)水平   如圖2A所示，隨著腫瘤組織細(xì)胞

16、的分化程度降低，整合素4的表達(dá)水平也相應(yīng)增高，其中以低分化水平的表達(dá)量最高。如圖2B所示，整合素4的表達(dá)水平在不同臨床分期的卵巢癌中也不一樣，在期、期中的表達(dá)水平相對(duì)于I期明顯增高，三者中以期的表達(dá)水平最高。3  討論   整合素家族是一組細(xì)胞膜糖蛋白受體。由于這類(lèi)蛋白可以介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與生存，通過(guò)參與細(xì)胞骨架重構(gòu)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，因此在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中具有重要的意義。一般在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這類(lèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能狀態(tài)均有不同程度的改變。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，其家族成員中的整合素4對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。整合素4由6和4兩個(gè)亞單位組成異二聚體，是

17、構(gòu)成半橋粒的重要組成部分。在多種組織來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中，整合素4的表達(dá)水平增高，并且脫離半橋粒結(jié)構(gòu)，游離分布于細(xì)胞膜，導(dǎo)致半橋粒結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞骨架重構(gòu)，腫瘤細(xì)胞脫離基底膜，失去極性。增高、游離的整合素4扮演著重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3和c-Jun，這時(shí)的細(xì)胞往往表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力、遷移力和侵襲力5,6。   本研究發(fā)現(xiàn)，整合素4在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)水平也有不同程度的增高。其中，良性腫瘤組織的整合素4略高于正常組織，交界性腫瘤的整合素4較良性進(jìn)一步升高，惡性腫瘤中，整合素 4增高的水平十分明顯，是正常組織的2倍以上。結(jié)果提示，隨著腫瘤惡性程度的

18、增高，整合素4的表達(dá)水平增高。   本研究實(shí)驗(yàn)將相同病理類(lèi)型卵巢癌的蛋白提取液混合后上樣檢測(cè)，消除了組內(nèi)差異帶來(lái)的影響。但是這種方法掩蓋了不同分化程度和不同臨床分期的惡性腫瘤組織間整合素4表達(dá)水平的差異。為了解上述2個(gè)因素與整合素4表達(dá)量之間的關(guān)系，研究進(jìn)一步將相同分化程度和相同臨床分期的腫瘤組織提取液混合后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著上皮性卵巢癌的分化程度下降，整合素4的表達(dá)水平相應(yīng)增高；而對(duì)臨床分期而言，早期上皮性卵巢癌的整合素4就有明顯增高，而在有轉(zhuǎn)移的臨床分期病例中，整合素4表達(dá)水平進(jìn)一步增加。結(jié)果表明，整合素4表達(dá)水平的增高預(yù)示著卵巢惡性腫瘤細(xì)胞分化程度的下降，遷移浸潤(rùn)能力的增強(qiáng)，因此其可以作為上皮性卵巢腫瘤預(yù)后的臨床指標(biāo)；整合素4在腫瘤臨床早、中期就有明顯的增高，表明其可以作為卵巢癌早期靶標(biāo)的候選物。【參考文獻(xiàn)】  1Mercurio AM, Rabinovitz I. Towards a mechanistic understanding of tumor invasion-lessons from the alpha6beta 4 integrinJ. Semin Cancer Biol,2001(2):129-141. Hood JD, Cheresh DA. Role of integrins in cel