雙水相萃取―高效液相色譜法檢測高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物

1、雙水相萃取高效液相色譜法檢測高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物摘要：通過 Plackett-Burman 試驗(yàn)，建立一種乙腈 -無 機(jī)鹽 -水雙水相萃取 -高效液相色譜法檢測高效氯氰菊酯及其 降解產(chǎn)物 3-苯氧基苯甲醛與 3-苯氧基苯甲酸， 確立雙水相萃 取體系的最佳條件為： V 乙腈 V 樣品溶液 =1 1，振蕩 時(shí)間 3 min ，氯化鈉 樣品溶液 =1 g 1 mL 。在最佳萃取 條件下，對(duì)生物降解體系中濃度分別為 10、100 mg/L 的底物 和降解產(chǎn)物平均回收率為 94.6% 98.3%，變異系數(shù)為 2.1% 3.4%。該方法可以同時(shí)檢測生物降解過程中高效氯氰 菊酯及其降解產(chǎn)物 3-苯氧基苯

2、甲醛與 3-苯氧基苯甲酸， 操作 簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞： 雙水相萃??； 高效液相色譜法； 高效氯氰菊酯； 3- 苯氧基苯甲酸； 3-苯氧基苯甲醛中圖分類號(hào)： O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1002-1302 （2015） 03-0268-03 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種廣譜、高效的殺蟲劑，由于其 廣泛使用而導(dǎo)致環(huán)境中存在大量殘留 1-2 。研究表明，擬 除蟲菊酯殘留會(huì)危害哺乳動(dòng)物和人類的健康，具有潛在的致 癌性、生殖毒性、神經(jīng)毒性以及引發(fā)急性中毒3-5 。同時(shí)， 高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯等多種擬除蟲菊酯的降 解中間產(chǎn)物 3-苯氧基苯甲酸也具有生殖毒性， 在土壤中遷移 性

3、比母體化合物更強(qiáng)，對(duì)環(huán)境更具危害。生物修復(fù)在降解和消除農(nóng)藥殘留方面具有安全、高效等 特點(diǎn)，是治理農(nóng)藥環(huán)境污染的有效途徑。利用微生物及其產(chǎn) 生的降解酶來消除農(nóng)藥污染已成為目前研究的熱點(diǎn)，而對(duì)降 解體系中農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的檢測是此類研究的基礎(chǔ)。目 前，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥常用的檢測方法為有機(jī)溶劑萃取-氣相色譜或者高效液相色譜法。氣相色譜法具有靈敏度高、分析 速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是不能對(duì)不易氣化或受熱易分解的農(nóng)藥進(jìn) 行檢測，對(duì) 3-苯氧基苯甲酸等酸性降解產(chǎn)物的檢測通常需要 衍生化。高效液相色譜法可以檢測分子量較大、極性強(qiáng)與離 子型的農(nóng)藥，具有檢測效率高、靈敏度高、速度快和操作自 動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)藥殘留

4、分析的重要方法。通常農(nóng)藥 萃取采用乙酸乙酯、環(huán)己烷等為萃取劑的液液萃取法，雖然 這些溶劑對(duì)殘留農(nóng)藥及降解產(chǎn)物有較好的溶解性，萃取回收 率高，但采用高效液相色譜法檢測時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)溶劑峰的干 擾，需要氮吹或其他凈化處理， 操作復(fù)雜， 增大了試驗(yàn)誤差。雙水相萃取法( aqueous two-phase extraction)是根據(jù)親 水性高分子聚合物或有機(jī)溶劑與無機(jī)鹽在水溶液中超過一 定濃度后可以形成兩相，利用目標(biāo)物在兩相溶液中分配系數(shù) 不同而進(jìn)行分離的方法 6 ，具有條件溫和、價(jià)廉、溶劑消耗較少等優(yōu)點(diǎn)，在生物物質(zhì)萃取及金屬離子分離測定中得到廣 泛應(yīng)用 7 ，如賈風(fēng)燕等使用雙水相萃取 -高效液相色譜

5、法檢 測魚肉樣品中 6 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，回收率為 81.1% 964%8 。乙腈是高效液相色譜常用的流動(dòng)相，采用乙腈-無機(jī)鹽水雙水相萃取，可以避免高效液相色譜檢測中溶劑峰對(duì) 擬除蟲菊酯及其降解產(chǎn)物峰的干擾，簡化凈化步驟，有利于 檢測分析。目前，有關(guān)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的雙水相萃取的報(bào) 道還比較少。本研究通過建立一種乙腈 -無機(jī)鹽 -水雙水相萃 取體系用于高效氯氰菊酯生物降解體系中底物及代謝產(chǎn)物 的檢測，以期對(duì)其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測具有借鑒意 義。1 材料與方法1.1 材料與試劑銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa) GF31 ，由中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微

6、生物中心(CGMCC )保藏，登記入冊編號(hào) CGMCC No.7173 ；95.8%高效氯氰菊酯 標(biāo)準(zhǔn)品，由廣西田園生物有限公司提供； 97.0% 3-苯氧基苯 甲醛與 99.0% 3- 苯氧基苯甲酸分別購于 J&K chemical LTD 與 Acros Organics ；乙腈色譜純，購于 Fisher 公司；其他常用藥 品，購于西隴化工股份有限公司。1.2 儀器與設(shè)備ULTIMATE 3000 高效液相色譜儀， 配有紫外檢測器， 美 國熱電集團(tuán)生產(chǎn)； LDZ4-1.2 離心機(jī)， 北京眾益中和生物技術(shù) 有限公司生產(chǎn)； EP214C 分析天平，梅特勒 -托利多儀器有限 公司生產(chǎn)；

7、H-1 微型漩渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司生 產(chǎn)。1.3 溶液配制與胞外酶制備20 g/L 高效氯氰菊酯貯備液的制備：準(zhǔn)確稱取 0205 8 g 高效氯氰菊酯原藥， 精確至 0.2 mg，用乙腈定容至 10 mL ；2 g/L 3-苯氧基苯甲酸貯備液的制備： 準(zhǔn)確稱取 0020 2 g 3-苯氧 基苯甲酸原藥，精確至 0.2 mg，用乙腈定容至 10 mL；2 g/L 3-苯氧基苯甲醛貯備液的制備：準(zhǔn)確稱取0.020 6 g 3- 苯氧基苯甲醛原藥，精確至 0.2 mg，用乙腈定容至 10 mL ；0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液的制備：稱取 Na2HPO4?12H2O 7.169 g、

8、KH2PO4 2.72 g ，用蒸餾水溶解并定容至 1 L，pH 值調(diào)節(jié) 至 7.0；無機(jī)鹽培養(yǎng)基 （ MS ）：MgSO4?7H2O 0.5 g 、KH2PO4 0.5 g、Na2HPO4?12H2O 1.0 g ，蒸餾水溶解并定容至 1 L，pH 值調(diào)至 7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、NaCl 5.0 g ，使用蒸餾水溶解并定容至 1 L，pH 值調(diào)節(jié)至 7.0。培養(yǎng)基在 121 條件下滅菌 20 min。胞外粗酶液的制 備：將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基裝于 250 mL 錐形瓶中，每瓶裝 液量為 30 mL ，120 滅菌 30 min；接入菌種，在 3

9、0 、 120 r/min 搖床中培養(yǎng) 18 h；將發(fā)酵培養(yǎng)液用低溫冷凍離心機(jī) 在 4 、 6 000 r/min 離心 15 min ；取上層清液，經(jīng) 045 m 濾膜過濾，再用 Milipore 10 kDa 超濾膜超濾獲得超濾截留液， 即為胞外粗酶液。1.4 雙水相萃取方法將高效氯氰菊酯貯備液用無機(jī)鹽培養(yǎng)基 （ MS）稀釋為 50 mg/L ；取 1 mL 溶液，加入 0.1 mL 1 mol/L 鹽酸酸化；加入 一定量乙腈，渦旋振蕩一定時(shí)間，再加入一定量的 NaCl 振 蕩，以 3 000 r/min 離心 10 min ，取上層液，通過 0.22 m 有機(jī)相膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜分

10、析。高效氯氰菊酯回收 率（ Recovery rate， R） 計(jì)算公式為： R=ACu/C0 ，其中， A 為稀釋倍數(shù)， Cu 為上相溶液中高效氯氰菊酯的量， C0 為初 始加入的高效氯氰菊酯的量。 3-苯氧基苯甲醛與 3- 苯氧基苯 甲酸雙水相萃取方法及回收率計(jì)算方法同上。 1.5 降 解體系中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物檢測將菌體 GF31 接種于含有 50 mg/L 高效氯氰菊酯的無機(jī) 鹽培養(yǎng)基中，一定條件下降解 3 d，取樣經(jīng)雙水相萃取后進(jìn) 行高效液相色譜法檢測。將胞外酶加入到含有 50 mg/L 高效 氯氰菊酯的磷酸鹽緩沖溶液中，一定條件下降解48 h，取樣經(jīng)雙水相萃取后進(jìn)行高效液相色

11、譜法檢測。1.6 高效液相色譜檢測檢測條件：色譜柱 AQUASIL C18 （4.6×250 mm×5 m）柱，紫外檢測器波長為 235 nm，流動(dòng)相為乙腈 水 =85 15（體積比，下同） ，流速為 1 mL/min ，溫度 30 ， 進(jìn)樣量 20 L ，采用自動(dòng)進(jìn)樣器控制。 采用外標(biāo)法定量， 高 效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0.678x+0.489 ，r2=0.999 7，其中， y 為高效氯氰菊酯總峰面積， mAU/min ， x 為高效 氯氰菊酯進(jìn)樣濃度， mg/L 。3- 苯氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方 程為 y=1.121x-0.169 ， r2=0.999

12、5，其中， y 為 3-苯氧基苯甲 酸峰面積， mAU/min ；x 為 3-苯氧基苯甲酸進(jìn)樣濃度， mg/L 。 3-苯氧基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=2.514x-0.137 ， r2=0999 3 ，其中， y 為 3-苯氧基苯甲醛峰面積， mAU/min ； x 為 3- 苯氧基苯甲醛進(jìn)樣濃度， mg/L 。2 結(jié)果與分析2.1 雙水相萃取優(yōu)化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選取可能影響高效氯氰菊酯萃取的3 個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)， 3 個(gè)因素分別為乙腈（ A ）、振蕩時(shí)間 （B）和氯化鈉量（ C），每個(gè)因素選取高水平 1 和低水平 -1 （表 1），以高效氯氰菊酯回收率為

13、響應(yīng)值（表2），利用Minitable 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的 t 值和可 信度水平。由表 3、圖 1、圖 2 可見，乙腈加入量對(duì)萃取有 顯著影響，乙腈加入量越少，萃取回收率越高，當(dāng)乙腈 樣品溶液 =1 1 時(shí)，高效氯氰菊酯回收率最高， 達(dá)到 98.0%； 當(dāng)乙腈 樣品溶液 =5 1 時(shí)，回收率僅為 84.4%。其他 2 個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)沒有顯著影響。因此，采用乙腈 樣品溶液 =1 1、振蕩時(shí)間 3 min 、氯化鈉 樣品溶液 =1 g 1 mL 為乙腈 -氯化鈉 -水雙水相萃取高效氯氰菊酯的最優(yōu)條件。2.2 回收率的測定 高效氯氰菊酯生物降解體系分別為菌體降解體系與酶 降解體系，菌

14、體降解在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行，酶降解在磷酸 緩沖溶液中進(jìn)行，分別考察無機(jī)鹽培養(yǎng)基和磷酸緩沖溶液中 高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物 3-苯氧基苯甲酸和 3- 苯氧基苯甲 醛的雙水相萃取法效果。 由表 4可見，對(duì) 10、100 mg/L 高效 氯氰菊酯、 3-苯氧基苯甲酸和 3- 苯氧基苯甲醛的平均回收率 為 94.6% 98.3%、變異系數(shù)為 2.1% 3.4%。有文獻(xiàn)報(bào)道， 平均回收率為 90%96%、變異系數(shù)為 1.1% 39%，即認(rèn)為 檢測方法比較精確 9 。因此，本試驗(yàn)方法可精確定量測定高 效氯氰菊酯、 3- 苯氧基苯甲酸和 3-苯氧基苯甲醛。2.3 降解體系中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物的檢測由圖

15、 3 可見，高效氯氰菊酯、 3- 苯氧基苯甲酸和 3-苯氧 基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品在 12 min 內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)完全分離， 符合分析要 求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在實(shí)際酶降解體系中，可以同時(shí)定量檢 測底物高效氯氰菊酯與其降解產(chǎn)物 3-苯氧基苯甲酸與 3-苯氧 基苯甲醛（圖 4）。同理， 菌降解體系中各物質(zhì)也可以定量 檢測（圖 5），但是僅檢測到 3-苯氧基苯甲酸，未檢測到 3- 苯氧基苯甲醛，這可能是因?yàn)榻到猱a(chǎn)生的3-苯氧基苯甲醛被菌體迅速轉(zhuǎn)化為 3-苯氧基苯甲酸。 Tallur 等發(fā)現(xiàn)，微球菌 （Micrococcus sp. ） CPN 1 可以把 3-苯氧基苯甲醛轉(zhuǎn)化為 3- 苯氧基苯甲酸 10 ，這與本

16、試驗(yàn)結(jié)論一致。3 結(jié)論 微生物降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有速度快、操作簡單、 減少二次污染、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景，目 前已有較多關(guān)于微生物降解擬除蟲菊酯的報(bào)道。3-苯氧基苯甲酸與 3-苯氧基苯甲醛是高效氯氰菊酯、 甲氰菊酯等多種擬 除蟲菊酯的主要代謝產(chǎn)物，是研究此類農(nóng)藥降解進(jìn)程及降解 機(jī)理的重要標(biāo)的物。目前，研究者采用不同方法分別檢測擬 除蟲菊酯和其降解產(chǎn)物 3- 苯氧基苯甲酸與 3-苯氧基苯甲醛 11-12 ，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究建立了一種乙腈 -無機(jī)鹽 -水雙水相萃取系統(tǒng)，用 于高效液相色譜法檢測生物降解體系樣品中高效氯氰菊酯 及其降解產(chǎn)物，具有萃取與凈化的優(yōu)點(diǎn)，操作簡便，

17、結(jié)果準(zhǔn) 確，能同時(shí)檢測氯氰菊酯生物降解體系中底物與降解產(chǎn)物， 這為其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和環(huán)境污染物的檢測提供了借 鑒。參考文獻(xiàn)：1 Mehler W T ， Li H Z ， Lydy M J ， et al. Identifying the causes of sediment-associated toxicity in urban waterways of the Pearl River Delta ， ChinaJ. Environmental Science & Technology ， 2011， 45（ 5）： 1812-1819.2 Li H Z ，Mehler W T

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