登革熱實驗室檢測規(guī)范指南規(guī)范

1、登革熱實驗室檢測標(biāo)準(zhǔn)指南標(biāo)準(zhǔn)附件 2登革熱實驗室檢測指南一、目的一及時發(fā)現(xiàn)、診斷病例。二及時了解伊蚊媒介攜帶登革病毒狀況。三病毒分型和溯源。四 為登革熱流行趨勢的預(yù)測、 預(yù)警和制定防治對策、 措施提供科學(xué)依據(jù)。二、檢測對象一疑似和臨床診斷病例按照登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn) WS216-2021。二伊蚊成蚊和幼蟲。三、樣本采集、保存和運輸一臨床標(biāo)本采集用無菌真空枯燥管，采集患者非抗凝血，及時別離血清，分裝 2 份，保存于帶螺旋蓋、 內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)， 標(biāo)記清楚后低溫保存， 其中 1 份用于現(xiàn)場實驗室檢測， 1 份用于上級預(yù)防控制機構(gòu)復(fù)核附件 1，附表 1。1 .登革熱臨床診斷病例及疑似病例，每次采集血液標(biāo)

2、本5mL 。2 .登革熱臨床診斷和疑似的住院病例包括初篩陰性，應(yīng)采集雙份血液標(biāo)本，入院當(dāng)天和出院前1 天各一份。3 .疫點首發(fā)病例，必要時應(yīng)采集第二份血標(biāo)本，距第一份血樣采集日期間隔在 7 天以上。二蚊媒標(biāo)本采集疫點內(nèi)采集的伊蚊成蚊及幼蟲， 分類鑒定后， 填寫媒介標(biāo)本采集信息表， 按照采集地點分裝，每管10-20 只。三標(biāo)本保存、運送標(biāo)本應(yīng)-70以下保存，血液標(biāo)本可-20以下保存，但不超過1 周。標(biāo)本運送時采用低溫冷藏運輸， 防止凍融， 樣本運輸應(yīng)遵守國家相關(guān)生物平 安規(guī)定。四、檢測內(nèi)容一實驗室檢測登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和/ 或縣市疾控機構(gòu)采集病例血清，檢測登革病毒抗原、核酸或抗體，檢測

3、流程參見圖 1。二復(fù)核檢測1 .送市或省級疾病預(yù)防控制機構(gòu)的臨床標(biāo)本，抽樣30%進行復(fù)核檢測，疫點首發(fā)病例需采用病原學(xué)和/或雙份標(biāo)本血清學(xué)方法復(fù)核檢測，爆發(fā)疫情復(fù)核檢測不少于 5 例，疫情少于 5 例者應(yīng)全部檢測，病毒核酸陽性標(biāo)本應(yīng)分型檢測。2 .疫點首發(fā)病例，重癥病例、輸入病例急性期標(biāo)本應(yīng)采用PCR方法進行分型檢測，陽性者別離病毒，從臨床標(biāo)本或所別離病毒中擴增 E 蛋白編碼基因， 完成序列分析。3 .每次爆發(fā)疫情應(yīng)開展病毒全基因組序列分析。4 .實驗室檢測陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對恢復(fù)期血清進行IgM 、 IgG抗體和 /或中和抗體檢測。三媒介標(biāo)本檢測捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲，進行核酸分型檢

4、測，并擴增病毒 E 蛋白編碼基因，完成序列分析。病毒核酸陽性的標(biāo)本由國家、 省或有條件的市級疾病預(yù)防控制機構(gòu)進行病毒別離、基因組序列分析。2 / 29登革熱實驗室檢測標(biāo)準(zhǔn)指南標(biāo)準(zhǔn)采集第2份標(biāo)本確診 登革熱臨床診斷 登革執(zhí)抗體檢測排除 登革熱登革熱疑似病例確診 登革執(zhí)編制報告，錄入病例診斷結(jié)果審批檢測報告發(fā)送檢測報告，樣本保存與運送圖1登革熱疑似病例實驗室檢測流程五、實驗室檢測方法一臨床標(biāo)本檢測1、病原學(xué)檢測病原學(xué)檢測主要適用于急性期血液標(biāo)本。1抗原檢測：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標(biāo)本NS1抗原檢出率高。標(biāo)本中檢 出NS1抗原可以確診病毒感染，適用于現(xiàn)場快速檢測，可用于早期診斷附件2, 2核酸檢測：一

5、般發(fā)病后 6 天內(nèi)血液標(biāo)本病毒核酸檢出率高。在病人血清中檢出病毒核酸， 可確診而且能夠分型， 可用于早期診斷， 但核酸檢測容易因污染而產(chǎn)生假陽性，因此要求嚴(yán)格分區(qū)操作附件4。 3病毒別離：一般發(fā)病后5 天內(nèi)血液標(biāo)本病毒別離率較高。將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞 C6/36 或哺乳動物細(xì)胞 BHK21 、 Vero 進行別離培養(yǎng) 附件 5 ，出現(xiàn)病變以后，用檢測抗原或核酸的方法鑒定病毒。別離到登革病毒可以確診，但其耗時長，不適于快速診斷。血清學(xué)特異性抗體檢測主要適用于發(fā)病5 天以后血液樣本， 但需注意可能與其他黃病毒感染發(fā)生交叉反響。 1血清特異性IgM 抗體：采用 ELISA 、免疫層析等方法檢測。 I

6、gM 抗體陽性， 提示患者可能新近感染登革病毒， 適用于登革熱早期診斷， 但單份標(biāo)本不能確診附件6。 2血清特異性IgG 抗體：采用 ELISA 、免疫熒光 IFA 、免疫層析等方法檢測。患者恢復(fù)期血清IgG 抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈 4 倍及以上升高可以確診附件7， 8。 3中和抗體：采用空斑減少中和實驗、微量中和實驗等方法檢測，可用于分型。 患者恢復(fù)期血清中和抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈 4 倍及以上升高可以確診。二媒介標(biāo)本檢測將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲，按照采集地點，每 1020只為一份進行研磨處理附件9。用 RT-PCR 的方法進行登革病毒核酸檢測見附件4。病毒核酸陽性的標(biāo)本進行病毒別離見附

7、件5。六、實驗室質(zhì)量控制一標(biāo)本采集、保存和運送采集的標(biāo)本要做好標(biāo)識， 并記錄標(biāo)本的根本信息和流行病學(xué)信息， 按本指南要求采集、保存和運送。二實驗室檢測1 .根據(jù)發(fā)病時間，按本指南要求選擇不同的檢測方法。2 .核酸檢測要防止各種污染，按操作標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立相應(yīng)對照。3 .應(yīng)對檢測試劑開展質(zhì)控評價。三 各級疾病預(yù)防控制機構(gòu)應(yīng)定期開展督導(dǎo)檢查、 實驗室技術(shù)人員培訓(xùn)與考核，及時發(fā)現(xiàn)問題。七、結(jié)果的報告和反響疫點首發(fā)病例、重癥病例和輸入病例實驗室檢測結(jié)果24 小時內(nèi)反響標(biāo)本送檢單位。省級疾病防控機構(gòu)應(yīng)每年1 月將上一年登革熱實驗室病原學(xué)包括核酸檢測、病毒別離、序列測定監(jiān)測結(jié)果，報國家疾病預(yù)防控制中心見附表2，將

8、結(jié)果發(fā)送至denguetest126 。八、生物平安登革熱實驗室檢測應(yīng)按照?病原微生物實驗室生物平安管理條例?等相關(guān)規(guī)定要求，做好生物平安工作。13 / 29附件：6.IgM 捕捉 ELISA 法 MacELISA 檢測登革熱IgM 抗體附表：附件 1血液標(biāo)本采集、血清別離、運送、保存標(biāo)準(zhǔn)化操作程序1 目的正確采集血液標(biāo)本、別離血清、運送和保存。2 范圍適用于有資質(zhì)的人采集登革熱患者或疑似患者血液標(biāo)本、別離血清、編號、分裝、保存和運送。3 操作步驟3.1 采血3.1.1 用 70%酒精擦拭靜脈穿刺部位待30秒鐘以上。3.1.2 然后用一根碘酊或碘伏棉簽消毒皮膚1-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒

9、 60 秒，從穿刺點向外以 1.5-2cm 直徑畫圈進行消毒。3.1.3 用 70%酒精脫碘。3.1.4 嚴(yán)格執(zhí)行三步消毒后 （注意對碘過敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒 60 秒鐘 ）， 待穿刺部位酒精揮發(fā)枯燥用無菌真空管， 采集患者非抗凝血5mL。3.2.1 輕緩顛倒采血管數(shù)次，使血液與促凝劑混勻后靜置，待血塊完全凝固放置時間過長會造成溶血，防止留置過夜。3.2.23000 rpm離心，5分鐘，然后用無菌吸管小心取上清轉(zhuǎn)入3支凍存管，應(yīng)防止吸取血細(xì)胞。3.2.23001 標(biāo)記。用標(biāo)簽紙或持久性標(biāo)記筆在凍存管的側(cè)壁標(biāo)記標(biāo)本編號，頂端標(biāo)記序列號，標(biāo)記清楚后將血清放進標(biāo)本盒，保存于2-8冰箱

10、待初篩檢測或運送保存。在編碼規(guī)那么為“地區(qū)拼音首字母JH年份2位月2位-序列號 3 位，如景洪市2021 年 8 月份采集的第 12份血標(biāo)本的血清編號為JH1308-012,凍存管頂端分別標(biāo)記 012-1, 012-2和012-3。3.3 運送保存。3.3.1 如果 24 小時能夠完成初篩檢測， 并將標(biāo)本運送至上級單位， 運送前應(yīng)將標(biāo)本保存于2-8冰箱，運送時采用低溫冷藏運輸。3.3.2 如果不能及時運送，運送前應(yīng)將標(biāo)本保存于-20冰箱，運送時采用干冰或低溫冷藏運輸。3.3.3 樣本長期保存應(yīng)記錄剩余血清量和盒中位置，保存于 -70以下冰箱。3.3.4 所有樣本運輸和保存應(yīng)遵守國家相關(guān)生物平安

11、規(guī)定。4 本卷須知4.1 使用后的注射器和針頭應(yīng)放置于耐扎的容器中，最后集中高壓消毒，在任何情況下均不應(yīng)試圖將針頭重新蓋帽。4.2 采血結(jié)束后脫掉手套并棄于耐高壓的廢棄袋中，以備集中高壓滅菌，并立即用肥皂和水洗手。4.3 假設(shè)發(fā)生針刺、皮膚破損或其它損傷，應(yīng)立即用肥皂和水清洗傷口，不要立即止血。4.4 當(dāng)血液污染了身體的任何地方或發(fā)生針刺等事故時， 均應(yīng)及時報告上級并按醫(yī)療救護規(guī)程進行評估和救護。附件 2酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1 抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的酶聯(lián)免疫法檢測患者血清中登革病毒NS1 抗原。2 適用范圍適用于患者血清或血漿中登革熱病毒NS1 抗原的快速檢測。3 實驗前準(zhǔn)備3.1 核

12、對被檢樣品血清或血漿患者的姓名、編號及檢測工程等。冰箱或冰上。4 檢測工程及參數(shù)本方法檢測工程為檢測血清或血漿中登革熱病毒抗原。5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長 450nm 的酶標(biāo)儀、登革病毒抗原檢測試劑盒酶聯(lián)免疫法 萬泰公司6 檢測的環(huán)境條件生物平安 二級實驗室 BSL-2 中進行 ,滅活后樣本在生物平安一級實驗室BSL-1內(nèi)進行。7 操作步驟7.1 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30 分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。7.2 配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。7.3 編號：將樣品對應(yīng)微孔板編號，每板設(shè)陰性對照 3孔，陽性對照2 孔和空白對照 1 孔。7.4

13、加稀釋液：每孔加稀釋液50人，空白孔除外。7.5 加樣：分別在相應(yīng)孔參加待測樣品或陰陽性對照各50山，空白孔除外。7.6 溫育：用封板膜封板后，置37溫育60分鐘。7.7 每孔加酶標(biāo)試劑50人，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。7.8 溫育：用封板膜封板后，置37溫育30 分鐘。7.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。7.10 顯色：每孔參加顯色劑 A、B液各50小，輕輕震蕩混勻，37c避光顯 色 15 分鐘。7.11 測定：每孔加終止液 50人，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長于 450nm處建議使用雙波長450nm/600-650nm檢測，用空白孔調(diào)零后測定各孔 A 值

14、。8 結(jié)果判定8.1 臨界值計算： 臨界值=0.10+陰性對照孔A 值均值 陰性對照孔A 值低于0.05者以 0.05計算 。8.2 陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A<0.1假設(shè)1孔A大于0.1應(yīng)舍 棄，假設(shè)兩孔或兩孔以上陰性對照大于0.1，應(yīng)重復(fù)實驗。8.3 陽性對照正常值范圍：A > 0.8.8.4 陽性判定：樣品A值臨界值者為登革病毒抗原陽性。8.5 陰性判定：樣品A值（臨界值者為登革病毒抗原陰性。9 意義結(jié)合臨床信息， 陽性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染， 但陰性結(jié)果并不排除登 革病毒感染的可能。附件 3膠體金免疫層析法檢測登革病毒 NS1 抗原標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的檢測患者血

15、液中登革病毒抗原。2 適用范圍檢測患者血清、 血漿、 全血中登革熱病毒抗原水平， 主要用于登革病毒感染 的輔助診斷。3 實驗前準(zhǔn)備3.1 核對被檢樣品血清或血漿患者的姓名、編號及檢測工程等。冰箱或冰上。4 檢測工程及參數(shù)本方法檢測工程為檢測血清或血漿中登革熱病毒抗原。5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、登革熱病毒抗原檢測試劑盒膠體金法6 檢測的環(huán)境條件生物平安 二級實驗室 BSL-2 中進行 ,滅活后樣本在生物平安一級實驗室BSL-1內(nèi)進行。7 檢測步驟7.1 將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫。7.2 當(dāng)準(zhǔn)備好測試時， 翻開密封的鋁箔袋， 取出檢測卡， 平放于水平桌面上。7.3 在檢測卡上標(biāo)

16、記病人的樣本號。7.4 加樣：用滴管從樣本中取1滴約30-45 L血清或血漿標(biāo)本，加于檢 測卡/條上的加樣區(qū)內(nèi)，另外加1滴約30-45山稀釋液，保證操作過程中沒有 氣泡產(chǎn)生。 如果加樣后30 秒鐘，沒有看到樣本移動，可能是由于樣本太黏稠，可在樣本加樣孔內(nèi)再加 1 滴樣本稀釋液。7.5 參加樣本后 20-25分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，并將結(jié)果拍照。8 結(jié)果解釋8.1 陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線C 出現(xiàn)肉眼可見條帶。8.2 陽性結(jié)果：質(zhì)控線C和檢測線T均出現(xiàn)肉眼可見條帶。8.3 無效結(jié)果：未肉眼可見的質(zhì)控線C8.4 質(zhì)量控制：如遇以下情況，請按上述操作步驟使用實驗室備用的陽性和陰性樣本對該批產(chǎn)品進行質(zhì)量控制：8.4

17、.1 新檢驗員使用本產(chǎn)品。8.4.2 使用新批號產(chǎn)品。8.4.3 試劑卡儲存溫度在2-30以外。8.4.4 測試區(qū)溫度在2-30以外。9 意義陽性結(jié)果說明檢測到登革病毒抗原， 結(jié)合臨床可以診斷為登革病毒感染； 陰 性結(jié)果說明沒有檢測到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。附件 4RT-PCR 法分型檢測登革病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的登革熱患者和/或媒介伊蚊標(biāo)本中病毒核酸的提取及PCR 分型檢測。2 適用范圍適用于患者血標(biāo)本及其傳播媒介標(biāo)本的檢測。3 檢測的環(huán)境條件在標(biāo)本中提取登革病毒RNA的實驗要求在BSL-2實驗室操作，PCR分型檢 測在專門 PCR 室或區(qū)域操作。4 實驗步驟實驗準(zhǔn)備提取

18、登革病毒 RNA 要求在 BSL-2 實驗室， PCR 分型在綜合實驗室獨立區(qū)域或?qū)ｉTPCR室操作。進入實驗場所之前，要事先準(zhǔn)備好所需試劑，樣品。預(yù)約實驗場所，并看前一位實驗者是否已經(jīng)清場。4.2 RNA 的提取4.2.1 使用 QIAampViral RNA Mini 試劑盒提取血清標(biāo)本中病毒RNA4.2.1.1 吸取560仙包含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的離心管中。4.2.1.2 向上述的液體中參加140小樣品，脈沖渦旋式混勻15秒，室溫孵育10 分鐘，簡單離心使離心管頂端液體落到底部。4.2.1.3 在樣品中參加560屋96100%的乙醇，混勻15秒，再簡單離心。4.2.1.4

19、 小心將630仙液體參加未浸濕的QIAamp小柱中，蓋好蓋，離心8000rpm/min 1min,棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。4.2.1.5 翻開QIAamp小柱的蓋子，重復(fù)步驟6,直至樣品全部離心。4.2.1.6 翻開蓋子，向柱中參加500仙l AW1緩沖液，蓋好蓋，離心8000rpm/min 1min,棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。4.2.1.7 翻開蓋子，參加500 nAW2緩沖液，蓋好蓋，離心 14, 000rpm/min 3min。登革熱實驗室檢測標(biāo)準(zhǔn)指南標(biāo)準(zhǔn)4.2.1 .將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min。h.將柱子置于一新的1.5ml離心管

20、上，參加50卜l陽E洗脫緩沖液，室溫孵育 1min,離心 8000rpm/min 1min。4.2.2 RNeasy Mini Kit提取媒介組織標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒 RNA4.2.2.1 從Kit中取出RLT液，根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝適量 RLT液按照1: 100 體積比分別參加,琉基乙醇，分裝至相應(yīng)的預(yù)先標(biāo)記好的微量離心管中，每管 600 人。4.2.2.2 將1501組織研磨混懸液分別參加相應(yīng)的 RLT液管中，充分混勻。4.2.2.3 混勻后依次參加750口 70%的乙醇，充分混勻。4.2.2.4 從Kit中取出帶收集管的濾柱，翻開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟 2 中的混合液750M參加濾柱中，12

21、000rpm,離心15s,棄收集管中的離心液。4.2.2.5 濾柱仍放回收集管上，將步驟 2剩余的混合液全部轉(zhuǎn)入濾柱中， 12000rpm,離心15s,棄離心液；4.2.2.6 于濾柱中參加 700 d Wash Buffer RW1 液，12000rpm,離心 15s。4.2.2.7 從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干凈的2mL收集管，將離心 后的濾柱移到新的收集管上，參加 500M Wash Buffer RPE液，12000rpm,離心 15s。4.2.2.8 棄收集管中的離心液，再于濾柱中參加 500 d Wash Buffer RPE液， 1300014000r

22、pm,離心 2min。4.2.2.9 將濾柱移到一個無 RNA酶的干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱 中參加 3050的 RNase-free Water,1溫靜置 1 3min。4.2.2.10 12000rpm,離心1min,離心液即為病毒 RNA,立即檢測或-70C以 下保存。4.3常規(guī)半套式RT-PCR方法檢測登革病毒核酸4.3.1 引物：引物序列見下表引物序列片段大小D15'-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAAC511CG-3'D25'-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGT511TC-3'TS15'

23、;-CGTCTCAGTGATCCGGGGG- 3'482(D1+TS1)TS25'-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3'119(D1+TS2)TS35'-TAACATCATCATGAGACAGAGC- 3'290(D1+TS3)TS45'-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3'392(D1+TS4)4.3.2 PCR 擴增根據(jù)實驗室內(nèi)所使用病毒核酸 PCR擴增試劑盒特點，正向引物 D1和反向引物D2配置第一輪PCR體系，進行第一輪PCR擴增。推薦反響條件為94c預(yù)變性2min,然后94c變性30秒，55c退火30秒

24、，72c延伸1分鐘， 反響40循環(huán)，最后72c延伸10分鐘。第二輪分型PCR擴增體系配置采用正向引物 D1與反向引物TS1、TS2、TS3 和TS4。推薦反響條件為94c預(yù)變性2min,然后94c變性30秒，55c退火 30秒，72c延伸1分鐘，反響30循環(huán)，最后72c延伸10分鐘。4.3.3 1.5%濃度瓊脂糖電泳分析，確定病毒型別。4.3.4 結(jié)果判讀4.3.4.1 陽性:1型：電泳顯示略小于500 bp的DNA片段。2型：電泳顯示略大于100bp的DNA片段。3型：電泳顯示略小于300bp的DNA片段。4型：電泳顯示略小于400bp的DNA片段。17 / 294.3.4.2 陰性：無特異

25、性核酸片段擴增。4.3.5 意義陽性結(jié)果可以確診登革病毒感染，可用于登革熱早期診斷引物/探針DEN-1 8973FDEN-1 9084C序列CAAAAGGAAGTCGTGCAATACTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC熒光標(biāo)記DEN-1 8998probeDEN-2 1443FDEN-2 1518cDEN-2 1469probeDEN-3 740FDEN-3 813CDEN-3 762probeDEN-4 904FDEN-4 992CDEN-4 960probeCATGTGGTTGGGAGCACGC FAM/BHQ-1CAGGTTATGGCACTGTCACGATCCATCTGCAG

26、CAACACCATCTCTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAAGGACTGGACACACGCACTCACATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCTACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTGTTGTCCTAATGATGCTGGTCG TCCACCTGAGACTCCTTCCA TTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCGHEX/BHQ-1TesasRed/BHQ-2Cy5/BHQ-34.4.2 實時熒光定量RT-PCR擴增實時熒光定量RT-PCR擴增反響配置體系，參考如下:RNA模板5dL緩沖液M也。，加水至總體積25小推薦反響條件為50c30min, 95

27、c2min, 95c 15s、60c30s反響40個循環(huán)4.4.3 結(jié)果判斷以熒光PCR反響的前315個循環(huán)的熒光信號作為本底信號，以本底信號 標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴增產(chǎn)生的熒光信號到達熒光閾值時所對應(yīng) 的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值Ct值，以Ct<35熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應(yīng)循環(huán) 數(shù)生成的曲線圖成“ S形的標(biāo)本，可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測陽性。4.4.4 意義是一種靈敏、特異、低污染的登革病毒 RNA檢測方法，可以定性或定量檢 測登革熱患者血清或蚊媒標(biāo)本中的登革病毒。登革熱實驗室檢測標(biāo)準(zhǔn)指南標(biāo)準(zhǔn)附件 5細(xì)胞培養(yǎng)別離登革病毒1 目的 別離登革病毒。2 適用范圍。2.2 經(jīng)研磨處理

28、的媒介蚊標(biāo)本參見附件 11。4 實驗前準(zhǔn)備4.1 核對被檢樣品：患者標(biāo)本應(yīng)核對患者的姓名、性別、年齡、編號及檢測工程等。蚊媒標(biāo)本應(yīng)核對標(biāo)本種類、編號、性狀等。4.2 生長狀態(tài)良好的單層登革病毒敏感細(xì)胞 C6/36， BHK21 ， VERO 等冰箱或置于冰上。5、操作步驟取10山患者血清或蚊懸液20山用Hank's液稀按1： 10稀釋至或備用。培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上清棄掉，用 Hank' s液洗滌2遍。5.3 將稀釋好的標(biāo)本接種細(xì)胞，接種C6/36細(xì)胞在28c吸附1小時，BHK21 細(xì)胞在37吸附1 小時，補加維持液至1mL ， C6/36 細(xì)胞在28培養(yǎng)，BHK21細(xì)胞在37培養(yǎng)

29、。5.4 第二天開始觀察細(xì)胞病變情況。如果沒有細(xì)胞病變，那么盲傳3代每次取細(xì)胞懸液0.1ml 接種細(xì)胞傳代。5.4.1 細(xì)胞抗原片的制備：出現(xiàn)“+細(xì)胞病變的細(xì)胞倒去維持液假設(shè)盲傳無細(xì)胞病變出現(xiàn)，仍然按此方法制備，用pH7.2 PBS洗滌2次，加PBS用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下， 吹散，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去PBS,細(xì)胞沉淀用0.2mlPBS吹散，滴加 在抗原片上，吹干，冷丙酮固定10分鐘，PBS沖洗2次，蒸儲水漂洗1次，吹 干備用；5.4.2 按順序滴加熒光標(biāo)記單克隆抗體 2孔，對照2孔力口 PBS，置濕盒內(nèi) 37水浴30分鐘；5.4.3 取出，用PBS沖洗3次，蒸儲水漂洗1次，吹干；

30、5.4.4 熒光顯微鏡觀察結(jié)果。5.5 其他檢測病毒抗原或核酸鑒定登革病毒參見附件2、 4、 5。5.6 結(jié)果判斷：免疫檢測有特異性黃綠色顆粒狀熒光，檢測出病毒NS1 抗原或病毒核酸可確定病毒別離成功。5.7 意義：從病人血清或蚊媒中別離出登革病毒，可確診登革感染。6 廢棄物處理所有實驗用品都應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)傳染病處理方法高壓處理。27 / 29附件 6IgM 捕捉 ELISA 法 MacELISA 檢測登革熱IgM 抗體1 目的檢測出登革病毒特異性 IgM 抗體。2 適用范圍適用于人血清或血漿中登革病毒特異性 IgM 抗體的快速檢測。3 樣品接收和準(zhǔn)備3.1 核對被檢樣品血清或血漿患者的姓名、

31、編號及檢測工程等。3.2 待測樣品在檢測前應(yīng)放置于 2-8冰箱或置于冰上。4 檢測工程及參數(shù)本方法檢測工程為檢測血清或血漿中病毒特異性 IgM 抗體5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長 450nm 的酶標(biāo)儀、登革病毒IgM 抗體檢測試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希?.1 抗原：陽性抗原：采用 C6/36 細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36 細(xì)胞為陰性抗原對照。5.2 抗人IgM以鏈單克隆抗體或多克隆抗體；5.3 登革病毒 IgM 陽性、陰性對照血清；5.4 辣根過氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；5.5 緩沖液：洗滌液：pH7.4 PBS T 0.05

32、吐溫20；稀釋液：pH7.4 PBS5%牛血清；封閉液： pH9.6 碳酸緩沖液 1牛血清白蛋白 ；5.6 顯色液：A/B 液5.7 終止液：4N H2SO46 檢測的環(huán)境條件生物平安 二級實驗室 BSL-2 中進行,滅活后樣本在生物平安一級實驗室BSL-1內(nèi)進行。7 檢測原理本方法采用抗人 以鏈捕獲人血清IgM抗體，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的病毒抗原物，用以檢測出血熱特異性IgM 抗體。具有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性。適用于出血熱的早期特異性診斷及其它實驗性研究。8 檢測步驟8.1 用稀釋液按效價稀釋抗人小鏈單克隆抗體，100膜/孔，加蓋，4 c過夜；8.2 棄去抗人小鏈，用洗滌液重復(fù)洗 3次

33、，甩干，加封閉液，100膜/孔，置37水浴孵育2 小時；8.3 棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。8.4 將待檢血清用稀釋液從1： 10 開始作 2 或 4倍連續(xù)稀釋，參加酶標(biāo)板孔中，100仙l/孔，同時參加已1: 10稀釋的陽性血清、陰性血清對照各 4孔，100屋/孔，置37c水浴孵育2小時；8.5 棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干，分別加4個型 DV 抗原及陰性抗原對照，100仙l/孔，4c過夜；8.6 棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正?？乖?個型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，100小l/ 孔，37水浴2 小時；8.7 棄去標(biāo)記物，

34、用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反響孔內(nèi)加 A/B 液各一滴，37 C,避光35分鐘；8.8 加終止液于每反響孔，一滴/孔。9 結(jié)果判斷 1目測方法：陽性對照孔呈明顯藍(lán)色， 陰性對照孔呈無色， 對照成立； 假設(shè)待檢血清孔呈明顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色 TMB ，那么標(biāo)本為登革熱IgM 抗體陽性，反之陰性。 2酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：于450nmTMB陽性對照孔OD值/陰性對照孔OD值，即P/N>2.1,對照成立；假設(shè)待檢血清孔 OD值與陰性對照孔OD比值>2.1,那么標(biāo)本為登革熱 IgM 抗體陽性，反之陰性。 陰性對照孔 OD 值小于 0.05按 0.05記，假設(shè)大于 0.05按實際數(shù)值計算10

35、意義陽性結(jié)果，提示患者新近登革病毒感染，用于登革熱早期臨床診斷。附件 7酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒 IgG 抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的檢測出登革病毒特異性 IgG 抗體。2 適用范圍適用于人血清或血漿中登革病毒特異性 IgG 抗體的快速檢測。3 實驗前準(zhǔn)備 1核對被檢樣品血清或血漿患者的姓名、編號及檢測工程等。 2待測樣品在檢測前應(yīng)放置于2-8冰箱或置于冰上。4 檢測工程及參數(shù)本方法檢測工程為檢測血清或血漿中病毒特異性 IgG 抗體5 檢測儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長 450nm 的酶標(biāo)儀、登革病毒 IgG 抗體檢測 試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希?.1 抗原：陽性抗原：采用 C6/36

36、細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36 細(xì)胞為陰性抗原對照。5.2 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 抗體；5.3 緩沖液：包被液：碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4 PBS含5%脫脂奶洗滌液： pH7.4 PBS T 0.05吐溫20；5.4 顯色液：A/B 液5.5 終止液：4NH2SO45.6 酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。6 檢測的環(huán)境條件生物平安 二級實驗室 BSL-2 中進行 ,滅活后樣本在生物平安一級實驗室BSL-1內(nèi)進行7 檢測步驟7.1 用包被液按工作濃度稀釋抗原，100山孔，4c過夜；7.2 棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌35次，甩干；7.3 將待檢血清用稀釋

37、液從1： 100開始作 2 或 4倍連續(xù)稀釋，參加抗原孔，100山孔，同時設(shè)陰、陽性對照，37c水浴1小時；7.4 棄去血清，用洗滌液洗滌56次；7.5 加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100山孔，37c水浴1小時；7.6 棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6 次，甩干；7.7 加顯色液：于各反響孔內(nèi)加 A/B液各一滴，37 C,避光35分鐘；7.8 加終止液于每反響孔，100 M /孔。8 結(jié)果判斷于450nmTMB陽性對照孔OD值/陰性對照孔OD值，即P/N>,對照 成立；假設(shè)待檢血清孔OD值與陰性對照孔OD比值，那么標(biāo)本為登革熱IgG 抗體陽性，反之陰性。 陰性對照孔 OD 值小于 0

38、.05 按 0.05 記，假設(shè)大于 0.05 按實際數(shù)值計算9 意義陽性結(jié)果，說明曾受到 DV 感染；恢復(fù)期血清抗體陽轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4 倍及以上升高那么可確診。附件 8免疫熒光法檢測登革病毒 IgG 抗體標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的免疫熒光法IFA檢測抗登革病毒IgG抗體。2 適用范圍適用于人血清或血漿中登革熱病毒特異性 IgG 抗體的快速檢測。3 實驗前準(zhǔn)備 1 核對被檢樣品血清或血漿患者的姓名、編號及檢測工程等。 2待測樣品在檢測前應(yīng)放置于2-8冰箱或置于冰上。5 檢測工程及參數(shù)本方法檢測工程為檢測血清或血漿中抗登革熱病毒 IgG 抗體6 檢測儀器設(shè)備和材料6.1 DV14型抗原片：DV標(biāo)準(zhǔn)毒株感染VERO或BHK21細(xì)胞制備，低溫 枯燥保存；6.2 對照：登革熱患者恢復(fù)期血清陽性對照 ，非登革熱患者血清陰性對照 ）；6.3 羊抗人或兔抗人 IgG 熒光素標(biāo)記抗體；6.4 常用稀釋液：pH7.27.4PBS伊文思蘭等；6.5 熒光顯微鏡。7 檢測的環(huán)境條件生物平安 二級實驗室 BSL-2 中進行 , 樣