漢黃芩素對移植人卵巢癌SKOV3細胞裸鼠組織端粒酶蛋白hTERT影響與凋亡相關(guān)性研究

1、漢黃芩素對移植人卵巢癌SKOV3細胞裸鼠組織端粒酶蛋白hTERT影響與凋亡相關(guān)性研究         08-12-03 13:40:00     作者：張漢英 黎丹戎 李力    編輯：studa0714   【摘要】 目的評價漢黃芩素對移植人卵巢癌SKOV3細胞裸鼠組織端粒酶蛋白hTERT影響與凋亡相關(guān)性。方法移植人卵巢癌SKOV3細胞的裸鼠隨機分為5組：漢黃芩素高劑量組，低劑量組，空白對照組，常規(guī)化療組（順鉑）和

2、聯(lián)合用藥（順鉑+漢黃芩素）組。采用抗生素-生物素過氧化酶復(fù)合物（S-P）免疫組化法檢測裸鼠組織中hTERT，Bcl-2，Bax蛋白及凋亡指數(shù)的表達。結(jié)果裸鼠組織經(jīng)漢黃芩素作用后，隨著漢黃芩素劑量的增大，對瘤體端粒酶hTERT蛋白表達有抑制作用，呈劑量依賴性。Bcl-2蛋白表達逐漸下調(diào)，與凋亡指數(shù)變化的表達呈相反變化趨勢，而Bax蛋白表達逐漸上調(diào)，與凋亡指數(shù)變化的表達呈同向變化趨勢。結(jié)論漢黃芩素在體內(nèi)具有抗腫瘤和抑制端粒酶活性的作用，抑制強度與劑量成正比，下調(diào)端粒酶活性，同時也伴隨細胞的凋亡，可能是藥物對端?；钚缘囊种坪蛯Χ肆＝Y(jié)構(gòu)的破壞，啟動了凋亡基因。    【關(guān)鍵詞】 漢

3、黃芩素 卵巢腫瘤 端粒酶 凋亡Abstract：Objective Regulating telomerase activation is an ideal way to treat cancer . Current studies show that wogonin has the attributes of  antioxidation and inhibition on the growth of tumor cells . This study aimed at evaluating the relationship between telomerase activation

4、 and apoptosis after wogonin administration in nude mice which implanted human ovarian cancer cells SKOV3. MethodsNude mice with implanted human ovarian cancer cells SKOV3 were randomly  divided into five groups, including high dose group ,low dose group ,  normal control group  , cis

5、platin  therapy group, and combined therapy group (cisplatin and wogonin) . The expression  of  hTERT, Bcl-2, Bax  and the apoptosis index were detected by immunohistochemistry.Results The results showed that wogonin could significantly suppress the growth of tumor compared with

6、controlled group.  The down expression of telomerase activation  and the effectiveness was related to the dose of wogonin . With the increase of suppressing on tumor ,the expression of Bcl-2 decrease  regularly , and it showed the opposite tendency of the apoptosis index . While the e

7、xpression of Bax increased regularly ,and it showed the same tendency with the change of apoptosis expression. ConclusionWogonis can suppress the growth of tumor and regulate telomerase activation.  The effectiveness is related to the dose of wogonin , the effect of wogonin would be better if i

8、t is combined with cisplatin in the treatment of tumor . It downregulates the activation of telomerase accompanied with apoptosis of cells ,the possible reason is that it damages the structure of telomerase and switch on  apoptosis  gene .Key words：Wogonin;     Tumor of

9、 the ovary;    Telomerase；  Apoptosis端粒酶是維持端粒長度、確保腫瘤細胞不退出細胞周期而得以永生化的關(guān)鍵之一。85% 的腫瘤細胞表達端粒酶活性，端粒酶的激活與腫瘤增殖密切相關(guān)，因此端粒酶成為治療惡性腫瘤的一個理想的靶點。近年來尋找和研究端粒酶抑制劑是國內(nèi)外研究的一個熱點。本課題組前期研究漢黃芩素表明在體外它具有誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡作用，能抑制端粒酶活性的表達1。本研究通過動物實驗，觀察漢黃芩素對腫瘤生長的抑制作用，并研究其對移植人卵巢癌SKOV3細胞裸鼠組織端粒酶蛋白hTERT影響與凋亡的相關(guān)性。1  

10、; 材料1.1  細胞人卵巢癌SKOV3細胞由廣西腫瘤防治研究所提供。培養(yǎng)于含10%的小牛血清，100 u/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)、傳代。1.2  藥物漢黃芩素是從黃芩根中分離出的一種單體，分子量為284 kDa，黃色晶體，其化學(xué)性質(zhì)、理化性質(zhì)、光譜數(shù)據(jù)參見文獻2。注射用順鉑（凍干型），齊魯制藥有限公司生產(chǎn)。1.3  裸鼠裸鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，4周齡，約20 g左右，雌性，生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2004-0005。2  方法2.1  動物分組及給藥將對數(shù)

11、生長期的人卵巢癌細胞SKOV3經(jīng)胰酶消化后，制備成107/ml的細胞懸液，每只裸鼠腋部皮下接種0.2 ml，約2周后接種原位出現(xiàn)腫瘤，成功率為27/30。選取其中25只裸鼠隨機分為5組即：漢黃芩素高劑量A組600 mg·kg-1·d-1；低劑量B組300 mg·kg-1·d-1；常規(guī)治療C組腹腔注射順鉑3 mg·kg-1·d-1；聯(lián)合用藥D組同時用腹腔注射順鉑3 mg·kg-1·d-1和灌胃給藥600 mg·kg-1·d-1；空白對照E組灌生理鹽水10 ml·kg-1·d-1

12、；采用灌胃給藥開始治療，共用藥10 d。停藥7 d后處死所有裸鼠，取瘤塊并分成約0.1 g/份，福爾馬林固定，石蠟包埋。常規(guī)HE染色。2.2  檢測裸鼠組織中hTERT，Bcl-2,Bax蛋白的表達方法采用抗生素-生物素過氧化酶復(fù)合物（S-P）免疫組化法。    組織切片0.4 m， 55烤片過夜，常規(guī)脫蠟，高壓修復(fù)抗原，PBS洗滌3次。3%H2O2孵育，室溫510min，H2O2要覆蓋組織，PBS洗滌3次，滴加1:100的1抗，孵育1 h。PBS洗滌3次。滴加生物素標(biāo)記的第2抗體，37，1015min， PBS洗滌3次。DAB顯色，用中性樹脂封片。&#

13、160;   對照設(shè)置：陽性對照片染色步驟同上述；陰性對照片用PBS代替一抗；其余步驟同上。2.3  檢測裸鼠組織中凋亡指數(shù)表達(TUNEL法)組織切片，常規(guī)脫蠟，20g/ml的蛋白酶K室溫下消化20 min，PBS洗5 min×3次。3%H2O2甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min。PBS洗5 min×3次。3%牛血清白蛋白阻斷20 min， PBS洗滌，TUNEL反應(yīng)液，60 min，PBS洗3次，加入轉(zhuǎn)換液，37，30 min。PBS洗滌3次。DAB顯色，35 min，蘇木素染1020 min，電吹風(fēng)吹干，中性樹脂封片。 &#

14、160;  對照設(shè)置：陽性照片為加TUNEL反應(yīng)液前用DNA酶消化30min，陰性對照片不加TUNEL反應(yīng)液中的TdT，其余步驟同上。2.4  免疫組化判斷2.4.1  對照染色每批染色的陽性對照片應(yīng)顯示為陽性，陰性對照片應(yīng)顯示為陰性，否則整批片重染。2.4.2  免疫組化染色陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)hTERT蛋白陽性反應(yīng)位于胞漿和胞核中表達；Bcl-2，Bax蛋白陽性反應(yīng)位于胞漿內(nèi)表達，呈棕褐色或棕黃色。2.4.3  免疫組化染色分級在全片上、下、左、右、中各隨機選取一個400倍視野，觀察每個視野中陽性細胞的染色強度及該強度細胞占視野中所有癌細胞的百分率

15、。    分級：按陽性細胞占總細胞數(shù)的百分率分4級，I級：5%25%；II級：26%50%；III級：51%75%；IV級：75%。5%作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，<5%作為陰性標(biāo)準(zhǔn)。    陽性細胞的染色強度分為4級：1級：（±）；2級：（+）；3級：（+）；4級：（+）。各陽性對照片的染色強度定為4級作為參照。一個視野的免疫組化染色得分6=該視野中的各種染色強度與該強度陽性細胞的百分率級別的乘積之和，即染色強度為1級的陽性細胞百分率級別×1染色強度為2級的陽性細胞百分率級別×2染色強度為3級的陽性細胞百分率級

16、別×3染色強度為4級的陽性細胞百分率級別×4。該組織的免疫組化染色綜合得分=5個視野的免疫組化染色得分之總和÷5。2.4.4  細胞凋亡判斷及記數(shù)凋亡細胞核固縮呈圓形或橢圓形、藍黑色，染色體沿核膜形成半月狀或新月狀，部分核凝固成致密小圓球形。光鏡下隨機選取5個以上高倍視野，每個視野不少于1000個細胞，按陽性細胞占細胞總數(shù)的百分率作為凋亡指數(shù)。2.5  統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗。多個樣本均數(shù)的比較，方差齊用q檢驗法，方差不齊用秩和檢驗；率的比較用確切概率法；相互依存關(guān)系的檢驗用方差分析F檢驗。3  結(jié)果3.1  腫瘤組織病理學(xué)觀察各組裸鼠解剖時均未見胸水、腹水；聯(lián)合組瘤體最小，易剝離，血供較差，切面灰白，并有液化壞死區(qū)域。顯微鏡下見對照組癌細胞生長旺盛，形成癌巢，細胞形態(tài)不規(guī)則，大小不等，核大呈圓形或卵圓形，核膜增厚，核分裂相較多。藥物作用后聯(lián)合用藥D組癌細胞呈大片壞死，結(jié)構(gòu)不清，大部分癌細胞崩解，