硫酸氨基葡萄糖對IL-1β誘導(dǎo)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1Ⅱ型受體和IL-1Ra的影響(1)

1、    硫酸氨基葡萄糖對IL-1誘導(dǎo)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1型受體和IL-1Ra的影響(1)    】 目的 研究硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）對IL-1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成HOC中型白介素1受體（interleukin-1 receptor type ，IL-1R）和白介素1受體抗體（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）的影響。方法 取10例骨關(guān)節(jié)炎患者行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨髁和脛骨平臺軟骨標(biāo)本，酶消化法獲取軟骨細(xì)

2、胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。在原代或第二代的人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-1（5ng/ml）和不同濃度的GS（2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）作用24h，應(yīng)用ELISA法檢測GS對IL-1誘導(dǎo)HOC合成白介素1受體抗體，應(yīng)用RT-PCR法檢測HOC中型白介素1受體（interleukin-1 receptor type ，IL-1R）的mRNA表達(dá)。 結(jié)果 IL-1刺激軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra增加（P0.01），合成IL-1R mRNA下降（P0.05）。與對照相比，2mmol/L和20mmol/L的GS均能抑制IL-1刺激軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-1R mRNA下調(diào)(P0.01），而且這種修飾

3、以濃度依賴的方式起作用(P0.01），而0.2mmol/L的GS不能影響IL-1下調(diào)IL-1R mRNA的表達(dá)(P0.05）。單獨(dú)使用20mmol/L的GS對軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-1RmRNA無影響(P0.05）。0.2mmol/L、2mmol/L和20mmol/L的GS對IL-1刺激軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra均無影響(P0.05）。結(jié)論 硫酸氨基葡萄糖能夠拮抗IL-1對人骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞合成IL-1R的向下調(diào)節(jié)，但不影響IL-1Ra的表達(dá)；這可能是硫酸氨基葡萄糖能保護(hù)軟骨的機(jī)制之一。        【關(guān)鍵詞】 骨性關(guān)節(jié)炎；

4、硫酸氨基葡萄糖；軟骨細(xì)胞；IL-1R        【Abstract】 Objective To study the effects of glucosamine sulfate modulating IL-1 induced expression of IL-1Ra and IL-1R in human osteoarthritic chondrocytes cultured in vitro. Methods Chondrocytes were harvested from ten OA patients u

5、ndergone TKR operation and cultured in monolayer cultures. Human recombinant IL-1（5ng/ml）and GS in different concentrations （2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）were administrated into culture medium of the first or second passage cells. IL-1Ra in the culture medium was evaluated by ELISA，and IL-1R

6、mRNA expression was examined by RT-PCR.Results Stimulation of human osteoarthritic chondrocytes with IL-1 for 24 hours resulted in significant enhanced production of IL-1Ra (P0.01) and decreased expression of IL-1R mRNA (P0.05). Pretreatment with 2mmol/L or 20 showed a dose-dependent inhib

7、ition of IL-1 induced down regulation of IL-1R mRNA expression (P0.01) while 0.2 mmol/L GS had no such effect(P0.05）. GS did not affects expression of IL-1Ra，either(P0.05）.Conclusion GS inhibits IL-1 induced down regulation of IL-1Rexpression in human osteoarthritic chondrocytes. Our result reveals

8、the possible mechanism of GS as a symptom and structure modifying drug in the treatment of OA.                骨關(guān)節(jié)炎是老年人最常見的關(guān)節(jié)疾病，它以軟骨結(jié)構(gòu)破壞為特征，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。致炎因子IL-1和它作用于軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的其他炎性介質(zhì)，干預(yù)了細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)化，加速了軟骨基質(zhì)的降解，誘發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡1，被認(rèn)為是骨

9、 關(guān)節(jié)炎中誘發(fā)和維持軟骨損壞的關(guān)鍵因子2。        IL-1的炎癥效應(yīng)通過細(xì)胞漿內(nèi)IL-1型受體來介導(dǎo)。IL-1型受體雖然也能與IL-1結(jié)合，但作為被裁切過的蛋白，它不能產(chǎn)生信號；白細(xì)胞介素1受體拮抗物（IL-1Ra）能與型受體特異結(jié)合，但沒有類白細(xì)胞介素1的活性。因此，調(diào)節(jié)IL-1Ra 和IL-1型受體的合成就成為阻斷IL-1的炎癥效應(yīng)靶標(biāo)之一3。        氨基葡萄糖（硫酸或鹽酸）(glucosamine sulfate&

10、#160;or chloride，GS)是治療骨性關(guān)節(jié)炎的常用藥，它具有保護(hù)軟骨的特性，并被認(rèn)為能修復(fù)損傷的軟骨。但就目前為止，它在體內(nèi)、外作用機(jī)制均不詳。本研究擬通過觀察硫酸氨基葡萄糖是否影響IL-1誘導(dǎo)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1型受體和IL-1Ra來探討GS的作用機(jī)制。        1 材料與方法        1.1 材料 3-硫酸氨基葡萄糖，購自Sigma公司。胰蛋白酶、型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和Tri

11、zol Reagent購自Gibco公司。重組人IL-1beta、反轉(zhuǎn)錄試劑盒A3500購自 Promega公司。IL-1Ra ELISA試劑盒購自R&D公司。PCR引物由北京賽百盛生物工程公司合成。CO2培養(yǎng)箱，丹麥Heto。酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD。PCR儀，美國Perkin Elmer，GeneAmp9600，基因測定儀、凝膠成像系統(tǒng)和計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，美國Pharmacia Biotach。電泳槽，美國Bio-Rad。        1.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 10例原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎住院患者（平均年齡6

12、7.3歲），行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)切割下來的股骨髁和脛骨平臺標(biāo)本，在預(yù)冷的無菌PBS液中將軟骨修剪成0.1mm3大小，0.25%的胰蛋白溶液37水浴中孵育30min，離心棄上清后加入0.2%膠原酶溶液，37恒溫?fù)u床中孵育6h以上。應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液沖洗收獲的細(xì)胞3次，計數(shù)，以2×105/ml的細(xì)胞密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含20% FCS的DMEM 5ml，放入37含5%的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。        1.3 實驗分組和給藥方法 取培養(yǎng)的第二代細(xì)胞按5×105/ml的密度接種在25

13、cm2培養(yǎng)瓶或六孔板中，隨機(jī)分組，細(xì)胞生長至80%匯合時更換培養(yǎng)液為不含F(xiàn)CS的DMEM，讓細(xì)胞饑餓過夜，然后同時加入IL-1（5ng/ml）和不同濃度的GS（2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）作用24h，離心，重復(fù)取上清后冷凍（-70）備用（檢測PGE2），細(xì)胞用以提取RNA或裂解蛋白。        1.4 ELISA法檢測軟骨細(xì)胞上清中IL-1Ra含量 按試劑盒求操作，每孔各加入待測細(xì)胞上清液200l，在450nm處測吸光度（OD）值，在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖

14、上查出相應(yīng)人IL-1Ra含量。            王曉濱，黃公怡，薛慶云，孫常太【摘】目的研究硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）對IL-1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。 

15、       1.5 RT-PCR法檢測IL-1R mRNA的表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取總RNA 2g逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性5min，然后95，45s；55，45s；72，90s，-actin(上游引物 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，下游引物5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3)進(jìn)行20個循環(huán)，IL-1R mRNA (上游引物5-CCAGGAGAAGAAGAGACACGGATG-3，下游引物5-CAGGACACAGCGGTAATAGCCAGC-3)進(jìn)行3

16、0個循環(huán)，72延伸5min。圖像分析：取5l PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳。目的條帶的吸光度V=平均吸光度值×條帶面積，IL-1R的表達(dá)強(qiáng)度Rv值=VIL-1R/Vactin。        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較應(yīng)用one-way ANOVA和Student-Newman-Keuls q檢驗，P<0.05為差異具有顯著性。     

17、60;  2 結(jié)果        2.1 GS對軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra的影響 如表1所示，與對照相比，IL-1刺激軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra增加，其差異具有非常顯著性（P0.01）。0.2mmol/L、2mmol/L和20mmol/L的GS對IL-1刺激軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra均無影響(P0.05）。 表1 GS對人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra的影響注：n=10，IL-1Ra以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與對照組比較，P0.01；與IL-1組比較，#P0.05  

18、60;     2.2 GS對軟骨細(xì)胞中IL-1R mRNA表達(dá)的影響 如表2和圖1所示，在人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，IL-1R mRNA呈低水平表達(dá)。與對照相比，IL-1刺激軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-1R mRNA下降，差異具有顯著性（P0.05）。2mmol/L和20mmol/L的GS均能抑制IL-1刺激軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-1R mRNA下調(diào)(P0.01），而且這種修飾以濃度依賴的方式起作用(p0.01）。而0.2mmol/L的GS則不能影響IL-1下調(diào)IL-1R mRNA的表達(dá)(P0.05）。但單獨(dú)使用20mmol/L的GS對軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-1Rm

19、RNA無影響(P0.05）。表2 GS對人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IL-1R mRNA表達(dá)的影響注：n=10，IL-1R mRNA的Rv值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與對照組比較，P0.05；與IL-1組比較，#P0.05；*P0.05；*P0.01    圖1 GS對IL-1誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)炎    軟骨細(xì)胞中COX-2 mRNA表達(dá)的影響Fig1 RT-PCR showed the effect of GS on IL-1-induced expression of COX-2 mRNA (305bp) in HO

20、C(control:-actin，539bp): Lane1 control; Lane2 IL-1; Lane3 IL-1 GS(0.2mmol/l); Lane4 IL-1 GS(2mmol/l); Lane5 IL-1 GS(20mmol/l); Lane6 GS(20mmol/l)        3 討論        與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相比，骨性關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是一個相對的非炎癥疾病，即骨性關(guān)節(jié)炎累及的軟骨并未顯示出紅、腫、熱、痛的

21、標(biāo)準(zhǔn)炎癥表現(xiàn)。然而，最近的研究表明，體外致炎基因（包括NO合成酶、COX-2、IL-1、TNF、IL-6和IL-8等）的超誘導(dǎo)作用導(dǎo)致炎性介質(zhì)自發(fā)分泌，對軟骨細(xì)胞的功能有破壞作用4，5。這種被稱為分子炎癥的反應(yīng)，主依賴于IL-1的自分泌，它誘導(dǎo)和維系著軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、軟骨基質(zhì)合成的失平衡狀態(tài)。        作為造成關(guān)節(jié)損壞的主致炎因子，IL-1在骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液中濃度均升高，且在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中高水平表達(dá)6。與正常組織相比，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中IL-1轉(zhuǎn)化酶表達(dá)增加，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞表達(dá)IL-1受體增加

22、而且對IL-1的作用更敏感7。IL-1通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞大量基因表達(dá)而大大改變了關(guān)節(jié)生理和軟骨代謝?？笽L-1治療在實驗動物模型中已證實有效避免了軟骨和骨的損耗，這表明了它在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用8。目前，抑制致炎因子IL-1的合成與活性，已成為緩解骨性關(guān)節(jié)炎的炎癥和軟骨降解的靶向之一。        體內(nèi)有兩種白細(xì)胞介素1的天然拮抗劑：白細(xì)胞介素1受體拮抗物（Interleukin-1 Receptor Antagonist，IL-1Ra）和白細(xì)胞介素1型受體（Interleukin-1 Receptor

23、Type ，IL-1R）。IL-1Ra能與IL-1受體特異結(jié)合，當(dāng)它與滑膜細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的IL-1R結(jié)合時，就抑制了IL-1誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞或軟骨細(xì)胞分泌前列腺素PGE2和組織降解酶類9。自然界有兩種IL-1的受體，IL-1的炎癥效應(yīng)通過細(xì)胞漿內(nèi)IL-1R型受體來介導(dǎo)。IL-1R雖然也能與IL-1結(jié)合，但作為被裁切過的蛋白，缺乏胞漿活性域，不能產(chǎn)生生物反應(yīng)信號9，10。通過捕捉IL-1，IL-1R就能調(diào)節(jié)IL-1的濃度和效應(yīng)，這種特性使得IL-1R成為阻斷IL-1的信號傳導(dǎo)通路的靶向之一11。        本研究中，

24、IL-1能夠誘導(dǎo)人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1 Ra增加（P0.05），表明IL-1Ra的活性與疾病的活動度正相關(guān)，這與文獻(xiàn)報道血漿中IL-1Ra濃度與關(guān)節(jié)炎病損指數(shù)成正比的結(jié)論一致11。加入GS后，IL-1Ra的產(chǎn)生量沒有變化（P0.05），表明GS不能修飾軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra。        Jouvene等11報道骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展伴隨著IL-1R合成下降，而且它在破壞性關(guān)節(jié)炎患者的體內(nèi)水平低于非破壞性關(guān)節(jié)炎體內(nèi)。我們也發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，加入IL-1后，人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1RmRNA減少（

25、P0.05）。鑒于骨關(guān)節(jié)炎軟骨內(nèi)IL-1的mRNA和IL-1上調(diào)、IL-1RmRNA下調(diào)，說明低濃度的IL-1在一個骨關(guān)節(jié)炎長期病程中起著加重炎癥、破壞軟骨代謝穩(wěn)態(tài)的作用。        我們的研究表明，在IL-1存在的前提下，氨基葡萄糖能夠上調(diào)人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-1RmRNA的表達(dá)，增加IL-1R的合成量，減少IL-1與IL-R的結(jié)合，從而抑制IL-1與靶細(xì)胞的結(jié)合，調(diào)節(jié)其生物效應(yīng)?；蚬δ芊治霰砻鲀?nèi)源性可溶性的Il-1R（sIl-1R）可以削弱IL-1的以下作用：對軟骨細(xì)胞蛋白多糖合成的抑制，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞

26、和滑膜細(xì)胞合成PGE2、NO，以及分泌基質(zhì)金屬蛋白酶10。因此，我們認(rèn)為GS上調(diào)IL-1誘導(dǎo)的人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成IL-1RmRNA是GS拮抗IL-1的致炎效應(yīng)從而緩解軟骨降解具有軟骨保護(hù)的機(jī)制之一。        4 結(jié)論            王曉濱，黃公怡，薛慶云，孫常太【摘】目的研究硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）對IL-1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的 

27、60;       本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。        硫酸氨基葡萄糖能夠拮抗IL-1對人骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞合成IL-1R的向下調(diào)節(jié)，但不影響IL-1Ra的表達(dá)；這可能是硫酸氨基葡萄糖保護(hù)軟骨的機(jī)制之一。 【參考文獻(xiàn)】    1 Blanco FJ，Ochs

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