運動對糖尿病大鼠骨胳肌細胞葡萄糖運載體4的影響

1、    運動對糖尿病大鼠骨胳肌細胞葡萄糖運載體4的影響楊曉冰吳毅李益明李云霞占飛胡永善朱尚權(quán)張新堂平蓓芳 研究表明葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運是骨胳肌細胞利用葡萄糖的主要限速步驟。在哺乳動物中，這一過程是由細胞膜上的葡萄糖運載體(glucose transporter, GLUT)參與并通過易化擴散來完成的1。在目前已知的6種GLUT中，骨胳肌細胞中主要存在兩種，即GLUT1和GLUT4，前者活性低，只在基礎(chǔ)狀態(tài)下起作用；后者活性高，是骨胳肌細胞的主要葡萄糖運載體。通過運動可提高骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量，促進肌細胞對葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運。但運動對糖尿病大鼠糖代謝的

2、作用機制尚未闡明。本實驗運用鏈脲佐菌素(STZ)引起的糖尿病大鼠為實驗動物模型，觀察糖尿病大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的變化，以及運動訓練對糖尿病大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的影響，探討運動改善糖尿病糖代謝紊亂的可能機制。 一、材料和方法 1.實驗動物：雄性Sprague-Dawley大鼠(體重180220g)，購自上海醫(yī)科大學動物部。隨機分成三組，分別為糖尿病組、糖尿病運動組和正常對照組，每組6只。糖尿病動物模型制備：大鼠腹腔內(nèi)注射STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.2)55mg/kg。第四日開始測尿糖和血糖，尿糖在，且血糖在16.7mmol/L以上者確定為糖尿病大鼠

3、。糖尿病大鼠隨機分為兩組，一組為糖尿病組，另一組則為糖尿病運動組。糖尿病運動組按Ploug方法2進行游泳訓練，每周游泳5天，共6周，前兩周每天游泳40分鐘，以后每天游泳60分鐘。 附表實驗前后大鼠血糖和血清胰島素的變化(±s) 數(shù)量 體重變化 血糖(mmol/L) 血清胰島素(mU/L) (g/d) 開始 結(jié)束 開始 結(jié)束 正常對照組 6 2.97±0.49 4.02±0.48 3.95±0.36 9.26±0.73 9.72±0.57 糖尿病組 6 1.40±0.28 19.88±2.03* 20.03±

4、;2.04* 3.91±0.25* 3.81±0.28* 糖尿病運動組 6 1.81±0.66 18.46±1.93* 14.0±3.25*# 4.03±0.26* 4.02±0.27* 注：與正常對照組比較，*P0.01；與運動前比較，#P0.01；與糖尿病比較，P0.01 最后一次游泳結(jié)束48小時后，尾靜脈采血，麻醉處死。第三組為正常對照組，大鼠腹腔內(nèi)注射等量的檸檬酸緩沖液。 2.大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的測定：(1)多克隆抗體的制備：按James方法3制備GLUT4蛋白羧基端12肽的多克隆抗體。具體過程如下：用

5、Merrifield固相合成法制備GLUT4蛋白羧基端12肽，以滅活的傷寒桿菌菌殼為載體，制成免疫原，免疫兔子。每3周加強一次。ELISA法測血清抗體滴度，獲滿意結(jié)果后，取血清，經(jīng)親和層析純化，透析，冷凍干燥，得到GLUT4蛋白羧基端12肽多克隆抗體干粉。(2)骨胳肌細胞膜的制備：用改良Klips方法4制備大鼠骨胳肌細胞膜。大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)麻醉，解剖后肢股四頭肌，肌肉約為10g，浸入0緩沖液A(250mmol/L Sucrose, 50mmol/L Tris, 0.2mmol/L EDTA, pH7.4)中，剪碎，勻漿，勻漿液以9000g離心10分鐘(4)，保

6、留上清，沉淀加入緩沖液A如上重復勻漿和離心，共3次，上清以190000g超速離心60分鐘(4)，取沉淀，加入少量緩沖液A后用玻璃勻漿器勻漿至均一，得骨胳肌細胞膜懸濁液，分裝后置于-70保存待用。膜蛋白濃度用Lowery改良法測定5。(3)Western blot法檢測骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量：取3組大鼠骨胳肌細胞膜50g，在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上，NC膜浸于含5%脫脂奶粉的PBS中，在水浴搖床中溫育60分鐘(37)，然后加入多克隆抗體過夜(4)。洗滌后與HRP標記的羊抗兔IgG水浴搖床溫育1小時(37)，充分洗滌后與ECL(增強化學發(fā)光劑

7、，購自英國Amersham公司)反應(yīng)1分鐘，即刻用Kodak底片爆光，洗片后進行掃描(島津雙波長薄層掃描儀)，定量。以正常對照組的GLUT4蛋白含量為100作為標準，計算其他兩組的相對含量。 3.生化指標的檢測：三組大鼠每兩天監(jiān)測尿糖，實驗前后測尾靜脈全血糖和血清胰島素，血糖濃度用快速血糖儀(美國強生公司產(chǎn)品,One Touch II型)檢測，血清胰島素濃度用放免法(中國華西糖尿病科技開發(fā)研究所試劑盒)測定。 4.統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異采用t檢驗。 二、結(jié)果 1.實驗前后大鼠血糖和血清胰島素含量比較：糖尿病組與糖尿病運動組的血糖和血清胰島素的比較無顯著性差異，但與正常

8、對照組比較，2組的血糖顯著升高(t值分別為5.74和6.65，P0.01)，而血清胰島素降低(t值分別為7.59和5.90，P0.01)。經(jīng)運動訓練后，糖尿病運動組血糖較運動前降低24%(t=4.64，P0.01)，血清胰島素無顯著變化，而糖尿病組和正常對照組實驗前后血糖和血清胰島素均無改變。運動訓練后，糖尿病運動組血糖較糖尿病組低30%(t=5.08,P0.01)，見附表。 2.3組大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的比較：結(jié)果顯示糖尿病大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白的含量比正常對照組下降30.7%，糖尿病運動組大鼠骨胳肌GLUT4蛋白的含量比糖尿病組升高60.8%。 三、討論 本實驗利用較小劑

9、量STZ(55mg/kg)來制備糖尿病大鼠動物模型。實驗中發(fā)現(xiàn)，STZ糖尿病大鼠血糖顯著升高，血清胰島素下降，骨胳肌細胞的GLUT4蛋白含量較正常對照組下降30.7%。Ramlal等6的研究顯示STZ大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量較正常下降37%，這可能是由于本實驗采用的STZ的劑量比Ramlal采用的劑量(65mg/kg)更小的緣故。Napoli等7同樣利用STZ糖尿病動物模型證實，糖尿病大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運功能的障礙與GLUT4蛋白內(nèi)在活性的降低、GLUT4蛋白含量及轉(zhuǎn)位機制障礙等因素有關(guān)。 Marette等8進一步對SHR/N-CP肥胖型糖尿病大鼠的研究表明，這類大鼠早期出現(xiàn)高血糖高胰島素血

10、癥，骨胳肌細胞的GLUT4蛋白的含量較正常對照組大鼠減少40%，認為高血糖的毒性作用可能與之有關(guān)，而且慢性高胰島素可能與高血糖起協(xié)同作用，導致骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的減少，同時實驗顯示細胞內(nèi)GLUT4 mRNA含量減少87%，說明由于GLUT4基因轉(zhuǎn)錄能力下降，使GLUT4蛋白合成減少，導致肌細胞攝取和利用葡萄糖的能力下降。本實驗中動物模型表現(xiàn)為高血糖和低胰島素血癥，同樣發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量明顯減少。Youn等9采用了鉗夾技術(shù)以維持STZ大鼠血中高胰島素和正常血糖濃度，研究STZ大鼠GLUT4蛋白水平隨時間變化的過程，雖然血糖維持在正常水平，但骨胳肌GLUT4蛋白水

11、平仍下降，糖尿病大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量均減少，從而對葡萄糖的轉(zhuǎn)運和攝取減少，出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象。GLUT4蛋白含量的減少可能與GLUT4基因轉(zhuǎn)錄功能的下降有關(guān)。 運動可改善外周組織對葡萄糖的攝取和利用，不同方式的運動后，正常大鼠骨胳肌GLUT4蛋白含量上升30%200%不等10-11。去神經(jīng)骨胳肌收縮研究進一步證實，收縮運動是骨胳肌GLUT4基因表達的一種調(diào)節(jié)因素12。Friedman等10在對肥胖大鼠進行跑臺運動訓練后發(fā)現(xiàn)，運動訓練可刺激骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的增加，從而提高骨胳肌細胞對胰島素的敏感性。本實驗中STZ糖尿病大鼠經(jīng)過6周的游泳運動后，血糖水平明顯低于運動前水平，

12、同時與糖尿病組大鼠相比，血糖水平明顯降低，而血清胰島素水平無明顯變化，說明運動后盡管糖尿病大鼠的血清胰島素仍處于較低的水平，但機體外周組織(主要是骨胳肌細胞)對葡萄糖的攝取和利用卻明顯增加，致血糖較運動前降低。通過對3組大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量的測定表明，糖尿病運動組大鼠骨胳肌細胞GLUT4蛋白含量明顯高于糖尿病組大鼠，GLUT4蛋白含量的增加可能與運動訓練促進糖尿病大鼠骨胳肌細胞GLUT4基因表達的增加有關(guān)。提示運動訓練可以提高糖尿病大鼠骨胳肌GLUT4蛋白的含量，GLUT4蛋白含量的增加可能是外周組織攝取和利用葡萄糖增加的主要原因之一。另外運動訓練改善了糖尿病機體外周組織對胰島素的

13、敏感性，促進機體對葡萄糖利用，從而使血糖明顯下降。 本課題為國家自然科學基金資助項目 3940012 作者單位：200040 上海華山醫(yī)院康復醫(yī)學科(楊曉冰、吳毅、李云霞、占飛、胡永善)，糖尿病研究室(李益明)；中科院上海生化所(朱尚權(quán)、張新堂、平蓓芳) 參考文獻 1Fink P, Wallace P, Brechtel G, et al. Evidence that glucose transport is rate limiting for in vivo glucose uptake. Metabolism, 1992,41:897-902. 2Ploug T, Stallknecht

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