腸激安方對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠T淋巴細(xì)胞和5羥色胺的影響

1、         09-09-27 14:24:00     編輯：studa20                       作者：唐洪梅，黃櫻華，李得堂,丘振文，閻雪【摘要】  【目的】觀察腸激安方對(duì)腹瀉型腸易激綜合征（IBS）模型大鼠

2、T淋巴細(xì)胞水平和5羥色胺（5HT）分泌的影響?！痉椒ā窟x用新生SD大鼠46只，隨機(jī)分成正常組，模型組，腸激安方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組，劑量分別為094、188、376g·kg-1·d-1），補(bǔ)脾益腸丸組（劑量為676g·kg-1·d-1）；采用直腸內(nèi)醋酸刺激法復(fù)制腸道高敏感大鼠模型，經(jīng)大鼠排便統(tǒng)計(jì)及腸道敏感性評(píng)估確認(rèn)造模成功后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組外周血CD+3、CD+4、CD+8T淋巴細(xì)胞亞群水平，采用免疫組化法觀察各組大鼠腸組織5HT陽性細(xì)胞數(shù)和免疫染色強(qiáng)度。【結(jié)果】模型組大鼠排便量顯著增加，腸道敏感性顯著升高，CD+4水平及CD+

3、4/CD+8比值顯著降低，CD+8水平顯著升高，5HT陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度顯著增加（均P001）；中藥低、中、高劑量組可減少大鼠排便量（治療第14天），降低腸道敏感性，升高CD+4水平及CD+4/CD+S比值，降低CD+8水平，減少5HT陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度（均P001）?！窘Y(jié)論】腸激安方治療IBS的作用可能與改善細(xì)胞免疫功能和腸道敏感性，減少5HT分泌有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  腸激安方/藥理學(xué)；腸易激綜合征/中藥療法；腸易激綜合征/免疫學(xué)；結(jié)腸/病理學(xué)；疾病模型，動(dòng)物；大鼠Abstract: ObjectiveTo observe the effect of Changjian Pre

4、scription (CP) on T lymphocytes count and 5hydroxytryptamine (5HT) secretion in rats with diarrhea predominant irritable bowel syndrome (IBS). MethodsFortysix neonatal SD rats were randomized into normal group, model group, low, middle and highdose CP groups (094, 188 and 376g·kg-1·d-1 res

5、pectively), and Bupi Yifei Pills group (676g·kg-1·d-1). Continuous internal rectal stimulation with acetate was used to induce the rat model of intestinal hypersensitive IBS. Flow cytometer was used for the quantitative analysis of peripheral levels of T lymphocytes subsets CD+3 , CD+4 and

6、 CD+8 , and immunohistochemical method was used to observe 5HTpositive cells number and the immunostaining intensity in the bowels of rats .ResultsIn the model group, the defecation volume and the intestinal sensitivity were increased, CD+4 level and CD+4/CD+8 decreased, CD+8 level increased, 5HTpos

7、itive cells number and the immunostaining intensity elevated (P001 compared with the normal group). The defecation volume 14 days after treatment and the intestinal sensitivity were decreased, CD+4 level and CD+4/CD+8 increased, CD+8 level decreased, 5HTpositive cells number and the immunostaining i

8、ntensity lowered in CP groups(P001 compared with the model group). ConclusionThe therapeutic mechanism of CP for IBS is probably related with the improvement of cellular immunity and intestinal sensitivity, and with the reduction of 5HT secretion. Key words:CHANGJIAN PRESCRIPTION/ pharmacology;

9、IRRITABLE BOWEL SYNDROME /TCD therapy;IRRITABLE BOWEL SYNDROME /immunology;COLON/pathology;DISEASE MODELS, ANIMAL;RATS腸激安方由痛瀉要方加減組成，具有疏肝健脾、清熱祛濕、行氣止痛及止瀉功效，主治慢性結(jié)腸炎、慢性消化不良、腹痛腹泄、胃納不振等。腸易激綜合征（IBS）是一種常見的慢性非器質(zhì)性腸功能紊亂性疾病，目前認(rèn)為內(nèi)臟敏感性增高是IBS最重要的病理生理特征之一1，它是一種腦腸調(diào)節(jié)異常的疾病，受神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫因素介導(dǎo)，并受心理社會(huì)學(xué)因素調(diào)節(jié)2。在受旋毛蟲感染活體實(shí)驗(yàn)中觀察到腸道平

10、滑肌功能的改變依賴于T淋巴細(xì)胞，這一結(jié)論支持腸平滑肌功能受免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的概念3。此外，T淋巴細(xì)胞在胃腸道感染后的神經(jīng)肌肉功能的介質(zhì)釋放中也起到了關(guān)鍵的作用。目前對(duì)腹瀉為主的IBS研究較多，5羥色胺（5HT）含量無論是在病人血漿中還是在結(jié)腸黏膜中均明顯增高4-5。本實(shí)驗(yàn)從腸道敏感性評(píng)估、T淋巴細(xì)胞亞群、5HT 免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度等角度探討中藥腸激安方的作用機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料與方法11試劑與儀器石蠟油（泰興科學(xué)儀器經(jīng)營部）； 醋酸、乙醚（廣州化學(xué)試劑廠）；T淋巴細(xì)胞亞群試劑盒（北京市晶美基因谷科技有限公司，批號(hào)：2A0231）；5羥色胺試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批

11、號(hào)：60382304）；PV6001 辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：09434）。HZSH電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療儀器五廠）；BP211D型精密天平（Sartorius AG）；ALTRA EPICS型流式細(xì)胞儀（貝克曼庫特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)蘇州有限公司）；TDL5A型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MS2微型搖床（廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司）；TP1020型自動(dòng)脫水機(jī)（萊卡公司）；EG1140H型石蠟包埋機(jī)（萊卡公司）；2255型B×50生物顯微鏡（萊卡公司）；HITACHI600型透射電鏡（日本）。12藥物制備腸激安方提取物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研

12、究中心提供（批號(hào)：20060511），加生理鹽水?dāng)嚢枞芙猓瞥?5g/mL的腸激安藥液；陽性對(duì)照藥 補(bǔ)脾益腸丸由廣州陳李濟(jì)藥廠生產(chǎn)（批號(hào)：K06087）,研碎成細(xì)粉，加生理鹽水?dāng)嚢枞芙夂笾瞥?g/mL的藥液。13實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生SD大鼠，SPF級(jí)乳鼠每8只與母鼠一起飼養(yǎng)，發(fā)育至24d后，將母鼠與幼鼠分離(實(shí)驗(yàn)用乳鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2006A010)。14造模、分組及給藥將新生SD大鼠隨機(jī)分為6組：正常組，模型組，腸激安方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組，劑量分別為094、188、376g·kg-1·d-1),補(bǔ)脾益腸丸組(劑量為676g·k

13、g-1·d-1)，每組10只。各組從第821天，每天給予直腸內(nèi)醋酸刺激，進(jìn)行內(nèi)臟高敏感大鼠模型造模，正常組每天直腸內(nèi)給予生理鹽水。經(jīng)大鼠排便統(tǒng)計(jì)及腸道敏感性等指標(biāo)評(píng)估，腹瀉型IBS模型復(fù)制成功后，在大鼠9周齡時(shí)分別灌胃給予腸激安藥液高、中、低劑量及補(bǔ)脾益腸丸藥液。正常組、模型組以等容積生理鹽水灌胃。15大鼠排便統(tǒng)計(jì)分別于中藥干預(yù)前1d，干預(yù)第7天，干預(yù)第14天，在籠內(nèi)墊清潔濾紙，觀察4h內(nèi)大鼠排便的糞點(diǎn)數(shù)。實(shí)驗(yàn)均在白天進(jìn)行。16腸激安方對(duì)IBS模型大鼠腸道敏感性的影響6上述新生期大鼠在刺激停止2周后，分別在第6、8周齡進(jìn)行腸道敏感性評(píng)估，驗(yàn)證模型是否成功。評(píng)估大鼠的腹部回縮反射(AW

14、R)：將血壓計(jì)、針管與自制指套氣囊用三通管連接，用針管向氣囊內(nèi)打氣時(shí)可以在血壓計(jì)上讀出氣囊內(nèi)壓力。6周齡大鼠在乙醚麻醉下，把用石蠟油潤滑后的氣囊經(jīng)肛門插入約5cm，用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾根部纏在一起，固定氣囊。大鼠蘇醒后，將其放在自制的透明玻璃籠內(nèi)，大鼠在此籠內(nèi)不能轉(zhuǎn)身。15min后待大鼠適應(yīng)環(huán)境，逐漸打氣擴(kuò)張腸道，分別測(cè)定引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的壓力閾值（mmHg），進(jìn)行行為評(píng)估。為得到準(zhǔn)確的評(píng)估結(jié)果，對(duì)每一閾值都重復(fù)進(jìn)行3次擴(kuò)張，數(shù)據(jù)取均值。在第8周再測(cè)1次，比較正常組與模型組壓力閾值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模成功后，從9周齡開始給藥治療，每日灌胃1次，共2周。治療后再次進(jìn)行腸道敏感性評(píng)估。1

15、7CD+3 、CD+4、CD+8T淋巴細(xì)胞亞群水平的檢測(cè)方法將末次給藥后的大鼠乙醚麻醉，眶靜脈采血051mL置乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝管中，取50LEDTA抗凝血，加入5L熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，混勻，避光孵育30min；加入溶血素1mL混勻，避光孵育1015min，至液體澄清透明，1 000r/min離心5min，棄去上清液；加入1mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗液混勻，1 000r/min離心5min，棄去上清液；將細(xì)胞懸浮于05mL PBS洗液中，振蕩混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群水平。18光鏡觀察大鼠腸組織5HT分泌情況將眶靜脈采血后的大鼠脫頸椎處死，取其距肛門10cm處的

16、降結(jié)腸2段，每段約2cm，其中一段進(jìn)行免疫組化染色：采用體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定，常規(guī)包埋，脫蠟、水化組織切片，切片經(jīng)純二甲苯脫蠟2次，每次68min，梯度酒精脫二甲苯各2min，自來水沖洗、PBS漂洗各3次，每次2min。體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物，PBS沖洗后，滴加5HT抗體孵育3060min，PBS沖洗3次，每次2min。滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次2min。用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。隨后在光鏡下觀察，隨機(jī)選擇連續(xù)的腸腺腔300個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算其中免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)數(shù)量,以每100個(gè)細(xì)胞中

17、所含陽性細(xì)胞數(shù)表示結(jié)果。并對(duì)每張切片染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估：0度：無染色信號(hào) ；1度：染色信號(hào)呈細(xì)顆粒狀，棕黃色，陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)50%以下；2度： 染色信號(hào)呈細(xì)顆粒狀，棕黃色，陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)50%以上，或染色信號(hào)呈粗顆粒狀、塊狀，棕黑色，陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)50%以下；3度：染色信號(hào)呈粗顆粒狀或塊狀，棕黑色，陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)50%以上。     09-09-27 14:24:00     編輯：studa2019統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS115軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。2結(jié)果21腸激安方對(duì)大鼠排便情況的影響表1結(jié)果顯示，

18、模型組糞點(diǎn)數(shù)與正常組比較差異有顯著性意義(P001)，表明大鼠排便次數(shù)明顯增多，腹瀉情況持續(xù)存在；治療第14天時(shí)，中藥低、中、高劑量組及補(bǔ)脾益腸丸組與正常組糞點(diǎn)數(shù)比較差異無顯著性意義（P005），與模型組比較差異有顯著性意義（P001），表明各給藥組對(duì)腹瀉排便情況具有明顯改善作用。表1腸激安方對(duì)大鼠排便情況的影響（略）22腸激安方對(duì)IBS模型大鼠腸道敏感性的影響表2結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物在造模后的第6周和第8周,其抬腹和拱背的壓力閾值均低于正常組(P001) ，說明其腸道敏感性顯著升高。經(jīng)過藥物治療后（第10周），中藥中、高劑量組及補(bǔ)脾益腸丸組大鼠抬腹和拱背的壓力閾值與正常組比較無顯著性差異（P

19、005），與模型組比較差異有顯著性意義(P001)，提示腸激安方能明顯改善模型所致的腸道敏感性異常。表2各組大鼠不同時(shí)期腸道敏感性評(píng)估（略）23各組CD+3 、CD+4、CD+8T淋巴細(xì)胞亞群水平變化與正常組比較各組的CD+3水平差異無顯著性意義（P005），模型組CD+4細(xì)胞水平較正常組顯著降低，而CD+8細(xì)胞水平則顯著升高，CD+4/CD+8比值顯著下降（均P001）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組CD+4、CD+8水平和CD+4/CD+8比值差異均有顯著性意義（P001）。說明用藥2周后，大鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能有所改善，逐漸恢復(fù)到正常水平。結(jié)果見表3。表3各組CD+3 、CD+4、C

20、D+8 T淋巴細(xì)胞亞群水平變化比較（略）24各級(jí)大鼠腸組織的5HT免疫染色病理切片觀察結(jié)果連續(xù)觀察各組標(biāo)本的300個(gè)細(xì)胞均可見5HT免疫染色陽性細(xì)胞，此類細(xì)胞多分布在腸腺腔基底部，以腸腺隱窩部位較多。模型組免疫組化染色陽性細(xì)胞體積較大，大多為錐形或圓形，染色強(qiáng)度較強(qiáng)（圖1-b，彩圖見第200頁）；正常組、各給藥組免疫組化染色陽性細(xì)胞體積較小，多為圓形，染色強(qiáng)度較弱（圖1-a、c、d、e、f，彩圖見第200頁)。與正常組比較，模型組5HT陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，免疫組化染色強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(均P001)；中藥低、中、高劑量組及補(bǔ)脾益腸丸組的陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度與正常組比較差異無顯著性意義（P005）,與

21、模型組比較5HT陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，免疫組化染色強(qiáng)度顯著降低(均P001) ，說明腸激安方能改善IBS模型大鼠5HT分泌增多的情況。結(jié)果見表4。表4各組5HT陽性細(xì)胞數(shù)與免疫組化染色強(qiáng)度比較（略）3討論目前已建立的與IBS相關(guān)的動(dòng)物模型較多，但大多是根據(jù)體外單因素建立的符合IBS某一方面的病理生理機(jī)制的動(dòng)物模型，而病證結(jié)合模型未見報(bào)道。情志因素與IBS癥狀的發(fā)作和加重有關(guān)，且情志所傷多引起肝郁。本實(shí)驗(yàn)選用的模型雖然是由化學(xué)炎癥刺激引起，但由于刺激處在乳鼠期，屬于早期生活事件引起的動(dòng)物模型，因此這類剌激對(duì)乳鼠也是一種情志因素刺激。其癥狀發(fā)生的直接機(jī)理是基于腸道高敏感性和高反應(yīng)性基礎(chǔ)上的腸道運(yùn)動(dòng)功

22、能異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物在造模后的第6周和第8周，其抬腹和拱背的壓力閾值均明顯低于正常組，說明其腸道敏感性顯著升高。經(jīng)過藥物治療后，腸道敏感性壓力閾值明顯高于模型組，說明腸激安方藥液能改善IBS模型大鼠的腸道敏感性，并使其恢復(fù)正常。外周血T細(xì)胞亞群在數(shù)量上的協(xié)調(diào)比例，特別是CD+4/CD+8比值更有助于反映機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力7。有研究表明，IBS的不同亞型之間，CD+4/CD+8比值存在相反的狀態(tài)：腹瀉型組和交替型組比值下降，便秘型組比值增高8，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組CD+4/CD+8比值顯著下降，提示本研究的IBS模型具有腹瀉型IBS的細(xì)胞免疫特征。IBS雖為功能性疾病，但仍存在體

23、內(nèi)免疫異常的情況，同時(shí)CD+4 、CD+8的細(xì)胞均值及CD+4/CD+8比值可以作為判斷IBS病情的指標(biāo)。本研究通過檢測(cè)大鼠外周血中CD+3、CD+4、CD+8水平，發(fā)現(xiàn)模型組CD+4細(xì)胞水平較正常組顯著降低，而CD+8細(xì)胞水平則顯著升高，致CD+4/CD+8比值顯著下降，因此可以認(rèn)為腹瀉型IBS存在著免疫異常，推測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的改變可能影響了細(xì)胞因子的變化，從而導(dǎo)致了腹瀉型IBS患者的腹痛腹瀉等癥狀的產(chǎn)生。中藥低、中、高劑量組及補(bǔ)脾益腸丸組CD+8和CD+4/CD+8的水平與正常組比較均無顯著性差異，說明用藥2周后，大鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能有所改善并逐漸恢復(fù)。5HT是一種廣泛存在于神經(jīng)

24、系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，參與了心理和神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)。研究表明IBS患者血漿和結(jié)腸組織5HT含量升高9-10； 5HT的異常升高會(huì)導(dǎo)致腸道動(dòng)力異常和內(nèi)臟感覺過敏，也是引起腹瀉的重要物質(zhì)11，提示腸道5HT和IBS患病關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物結(jié)腸組織分泌的5HT免疫組化染色陽性細(xì)胞明顯多于正常組，5HT染色明顯加深；各治療組均能不同程度地減少5HT免疫組化染色陽性細(xì)胞的數(shù)量，且5HT染色變淺。表明腸激安方能降低IBS模型大鼠分泌增多的5HT，改善因5HT的異常升高而導(dǎo)致的腸道動(dòng)力異常和內(nèi)臟感覺過敏，改善腹瀉癥狀。本研究結(jié)果表明，腸激安方治療IBS的作用可能與改善細(xì)胞免疫功能和腸道敏感性，減少5HT分泌有關(guān)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1劉友章,雷力民.腸易激綜合征的研究現(xiàn)狀J.中華現(xiàn)代醫(yī)藥, 2002，4:255.2Ringel Y,Sperber AD,Drossman DA.Irritable bowel syndromeJ. Annu Rev Med,2001,52:319.3Vermillion DL,Ernst PB,Collins SM.T2 lymphocyte modulation of intestinal muscle func