缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用(1)

1、    缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用(1)    】 目的 探討缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用。方法 復(fù)制SD大鼠腸缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為4組(n=8)：假手術(shù)組(S)、缺血再灌注組(I/R)、缺血預(yù)處理組(IPC)、缺血后處理組(Ipost)。比較各組大鼠腸黏膜丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性變化；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞凋亡發(fā)生率；Chius評(píng)分法觀察腸黏膜的損傷情況。結(jié)果 與I/

2、R組相比，IPC組和Ipost組大鼠腸黏膜MDA含量和MPO活性均顯著降低，而SOD活性明顯升高；再灌注后可見(jiàn)明顯的腸黏膜細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Ipost組和IPC組凋亡指數(shù)較I/R組顯著下降，組織病理?yè)p傷亦明顯減輕。Ipost組和IPC組相比，各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異。結(jié)論 缺血后處理可通過(guò)抑制再灌注后氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生，保護(hù)抗氧化系統(tǒng)，從而抑制腸黏膜細(xì)胞凋亡，減輕腸缺血再灌注損傷。 【關(guān)鍵詞】 缺血再灌注；缺血后處理；缺血預(yù)處理；細(xì)胞凋亡；腸黏膜腸缺血再灌注損傷與臨床許多疾病和病理過(guò)程有密切關(guān)系，細(xì)胞凋亡在其損傷的病理過(guò)程中發(fā)揮重作用12。1986年Murry等提出心肌在經(jīng)受多次短暫缺血再灌后，能在隨

3、后的長(zhǎng)時(shí)間缺血中延遲并減輕心肌損傷，即缺血預(yù)處理。已證實(shí)，這一現(xiàn)象存在于不同種屬的不同組織器官中34。但由于這種預(yù)處理需在缺血前施予，從而使其臨床應(yīng)用價(jià)值受限。Zhao等5于2003年首先在心臟缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究中證明，在再灌注一開(kāi)始采用數(shù)個(gè)循環(huán)的短暫的灌注/阻斷之后全面恢復(fù)心臟的再灌注，能對(duì)缺血再灌注心臟產(chǎn)生抗損傷作用，從而提出了一種新的外科干預(yù)措施缺血后處理。隨后的研究6也證實(shí)缺血后處理能夠縮小心肌梗死范圍，降低心律失常的發(fā)生率。這種缺血后處理對(duì)缺血再灌注器官的抗損傷作用是否具有普遍性，目前尚不能確定。因此，本研究擬通過(guò)復(fù)制大鼠腸缺血再灌注損傷模型，研究缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏

4、膜的抗損傷作用，并探討其可能的機(jī)制，為腸缺血再灌注的臨床治療提供新的理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 主試劑 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，原位凋亡檢測(cè)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠32只，體重230-280g，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，術(shù)前禁食12h，不禁水。1.2.1 動(dòng)物模型復(fù)制 腹腔注射200g/L烏拉坦(1g/kg)麻醉后，仰臥固定于操作板上，消毒后取腹正中切口長(zhǎng)約3cm進(jìn)腹，用溫鹽水紗布將腸管推向左側(cè)腹腔，暴露右

5、腎內(nèi)上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery, SMA)，在其根部用無(wú)創(chuàng)傷血管夾夾閉阻斷SMA血運(yùn)45min，造成腸缺血模型，然后松夾，再灌注1h后經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死。1.2.2 動(dòng)物分組及處理 動(dòng)物隨機(jī)分為4組(n=8)：假手術(shù)(S)組：僅行開(kāi)腹，分離SMA不夾閉；缺血再灌注(I/R)組：方法見(jiàn)模型復(fù)制；缺血預(yù)處理(IPC)組：夾閉SMA 5min和松夾5min作為預(yù)處理，2個(gè)循環(huán)，余同I/R組；缺血后處理(Ipost)組：缺血45min后即刻行3個(gè)循環(huán)的灌注30s/阻斷30s，余同I/R組。1.3 標(biāo)本收集 動(dòng)物被處死后，取小腸回盲部10cm以

6、上的腸管。經(jīng)冰鹽水漂凈，濾紙吸干，沿腸管長(zhǎng)軸切開(kāi)，用載玻片輕輕刮取腸黏膜部分，立即-70分裝凍存，2cm腸組織經(jīng)40g/L甲醛溶液固定，常規(guī)制備小腸全層組織石蠟切片，分別進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和常規(guī)HE染色。1.4 觀察項(xiàng)目 分光光度法測(cè)定腸黏膜MPO、SOD活性以及MDA含量。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。按Chiu氏六級(jí)評(píng)分分析，取平均值。TUNEL法檢測(cè)腸黏膜細(xì)胞凋亡。按TUNEL試劑盒步驟進(jìn)行，以胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性。每張切片均在高倍鏡(400倍)視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目及總細(xì)胞數(shù)目。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。以5個(gè)視野的均值代表每

7、只動(dòng)物的凋亡指數(shù)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 腸黏膜MDA含量和SOD、MPO活性的變化 與I/R組相比，Ipost組和IPC組大鼠腸組織MDA含量和MPO活性均顯著降低(P<0.01)，而SOD活性則明顯升高(P<0.01)；Ipost組與IPC組相比，各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異(表1)。表1 腸黏膜MDA含量及SOD、MPO活性變化（略）    2.2 腸黏膜組織病理學(xué)改變

8、 光鏡下，S組腸黏膜絨毛完整，上皮下間隙無(wú)擴(kuò)展，損傷均為0級(jí)；I/R組大鼠腸黏膜有多部位不同程度的上皮脫落、黏膜下水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張、瘀血等；Ipost組和IPC組病理學(xué)改變有所減輕，組織損傷程度評(píng)分低于I/R組(P<0.01)。2.3 腸黏膜細(xì)胞凋亡率的變化 S組大鼠腸絨毛頂部、固有層和黏膜下層有極少量散在分布的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞(圖1A)；I/R組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，分布范圍從絨毛頂部擴(kuò)大到中、底部，固有層和黏膜下層細(xì)胞凋亡亦明顯加重，凋亡率大于S組(P<0.01，圖1B)；Ipost組和IPC組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及分布范圍則明顯少于I/R組(P<0.01，圖1C、1D)，Ipos

9、t組和IPC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 討 論腸缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中以氧自由基的損傷為最重的發(fā)病環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)腸缺血再灌注后腸黏膜細(xì)胞以凋亡為主，而氧化損傷是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重誘因7。關(guān)于氧自由基誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，目前大多認(rèn)為氧自由基可直接與細(xì)胞膜表面不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，也可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，引起線粒體膜電位下降、呼吸鏈解偶聯(lián)、細(xì)胞色素C和其他促凋亡因子釋放。細(xì)胞色素C、凋亡蛋白活化因子(Apaf1)和caspase9復(fù)合物的形成，激活caspase3，后者啟動(dòng)內(nèi)在的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)8。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，I/R組大鼠腸黏膜MPO活性和脂質(zhì)過(guò)氧化物終產(chǎn)物MDA含量增加，而抗

10、氧化物酶SOD活性顯著降低，表明其保護(hù)組織細(xì)胞免受毒性氧自由基損傷的效能減弱，過(guò)量的氧自由基可直接造成生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究表明，在再灌注最初的幾分鐘內(nèi)由于突然獲得氧的情況將會(huì)加速ATP的合成，但同時(shí)也加劇了細(xì)胞內(nèi)Ca2 超載和中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量氧自由基，從而導(dǎo)致再灌注損傷9。本實(shí)驗(yàn)所采用再灌注前、反復(fù)短暫的預(yù)再灌注、停灌注的缺血后處理方案，在某種意義上相當(dāng)于有控制的緩慢間歇性復(fù)氧，可減少突然全面復(fù)氧時(shí)氧自由基的大量產(chǎn)生，并刺激細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和自由基清除劑的釋放而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。與I/R組相比，Ipost組腸黏膜中MDA含量、MPO活性明顯下降，而SOD活性則

11、顯著升高，與IPC組無(wú)顯著性差異，同時(shí)腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)亦明顯下降。說(shuō)明缺血后處理在再灌注早期應(yīng)用可減少再灌注后氧自由基的過(guò)度生成并加速其清除，減輕氧自由基對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，阻斷氧自由基凋亡途徑，從而拮抗腸黏膜細(xì)胞凋亡的發(fā)生，發(fā)揮其抗缺血再灌注損傷的作用。綜上所述，腸缺血再灌注損傷后大鼠存在明顯的腸黏膜損害。再灌注期間氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生引發(fā)腸黏膜細(xì)胞凋亡參與了腸缺血再灌注損傷。缺血后處理能降低氧自由基的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞在腸黏膜內(nèi)的聚集、保護(hù)抗氧化系統(tǒng)，從而減輕細(xì)胞凋亡和再灌注損傷。采用合理的缺血后處理不僅能實(shí)現(xiàn)抗缺血再灌注損傷作用，而且與缺血預(yù)處理相比，具有操作簡(jiǎn)單、方便、可行的特點(diǎn)，

12、易為外科醫(yī)生所接受。            作者：褚薇薇，武步強(qiáng)，沙煥臣，王殿華 【摘】目的 探討缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠腸黏膜的抗損傷作用。方法         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。【參考文獻(xiàn)】1Olanders K, Sun Z

13、, Borjesson A, et al. The effect of intestinal ischemia and reperfusion injury on ICAM1 expression, endothelial barrier function, neutrophil tissue influx, and protease inhibitor levels in rats J. Shock, 2002,18(1):8692.2Wu B, Ootani A, Iwakiri R, et al. Ischemic preconditioning attenuates ischemiar

14、eperfusioninduced mucosal apoptosis by inhibiting the mitochondriadependent pathway in rat small intestine J. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004, 286(4):G580G587.3景桂霞，溫健，王偉. 高氧液預(yù)處理對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 J. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2005, 26(4):336339.4段東曉，張桂紅，邢瑩,等. 低氧預(yù)處理大鼠缺血再灌注腦組織缺氧誘導(dǎo)因子1的表達(dá) J. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)

15、，2004, 39(6):974976.5Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning J. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003,285(2):579588.6Kin H, Zhao ZQ, Sun HY, et al. Postconditioning attenuates myo

16、cardial ischemiareperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion J. Cardiovasc Res, 2004,62(1):46.7Hoffman JW, Gilbert TB, Poston RS, et al. Myocardial reperfusion injury: etiology, mechanisms, and therapies J. Extra Corpor Technol, 2004, 36(4):391411.8Gateau Roesch O, Argaud L, Ovize M. Mitochondrial permeability transi