結(jié)核分支桿菌H37Rv株菌體抗原單克隆抗體制備、特性分析及純化

1、    結(jié)核分支桿菌H37Rv株菌體抗原單克隆抗體制備、特性分析及純化        【摘要】目的利用單克隆抗體技術(shù)分析分支桿菌多肽抗原的共性和個性，建立純化單克隆抗體的最佳方法。方法按常規(guī)方法制備單克隆抗體。分泌單克隆抗體陽性雜交細(xì)胞株的篩選采用ELISA法，確認(rèn)采用免疫印跡法。24種分支桿菌菌株均生長于改良羅氏培養(yǎng)基上，H37Rv株分別生長于改良羅氏培養(yǎng)基和蘇通液體培養(yǎng)基上。單克隆抗體的純化采用硫酸銨沉淀法、辛酸沉淀法和離子交換法。結(jié)果經(jīng)篩選獲得14株單克隆抗體雜交細(xì)胞瘤

2、。其中，C2、7C12單克隆抗體所抗的76 000、16 000抗原成份為分泌抗原，76 000抗原存在于24種分支桿菌菌體中，為共同抗原。16 000抗原僅存在于H37Rv，H37Ra，牛分支桿菌，BCG株中。單克隆抗體免疫印跡結(jié)果顯示，分支桿菌H37Rv株在不同培養(yǎng)條件下，其40 000/38 000多肽抗原表達(dá)不同。單克隆抗體純化以硫酸銨沉淀法回收率最高，離子交換法獲得的單抗純度最高，辛酸沉淀法可以有效地去除白蛋白，并具有簡單、省時等優(yōu)點(diǎn)。單克隆抗體的相對親和力均在10-410-7 之間。結(jié)論C2、7C12單克隆抗體均抗結(jié)核分支桿菌H37Rv株的分泌抗原成份。40 000/38 000多

3、肽抗原為結(jié)核分支桿菌H37Rv株固體培養(yǎng)菌體特有。單抗純化結(jié)果顯示離子交換層析法適用于科研分析，而辛酸沉淀法則適用于大量腹水中單抗的純化?！娟P(guān)鍵詞】單克隆抗體；分支桿菌屬；分支桿菌，結(jié)核Production，characterization and purification of monoclonal antibodies against antigens of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strainLU Xuedong，ZHANG Xiaoyan，ZHANG Yinhui(Laboratory of Microbiology，Dept.of Shann

4、xi Provincial Geriatric Research Center,Shaanxi Provincial Hospital,Xian 710068,China)【Abstract】ObjectiveUsing monoclonal antibody (McAb) technique to analyze polypeptide antigens of Mycobacterium strains and try to find out the best method for purification of McAb.MethodsMcAbs against H37Rv strain

5、were produced by routine procedure.McAb-producing hybridomas were detected by ELISA and immunoblots technique.24 strains of mycobacterium were grown on Loewenstein-Jensen medium for 1 to 3 weeks at 37.H37Rv strain were grown on Loewenstein-Jensen medium or Sauton liquid medium.Ammonium sulfate，capry

6、lic acid precipitation and ion exchange chromatography methods were used to purify McAbs against antigens of H37Rv strain.Results14 McAb-produing hybridomas were obtained.C2 McAb reacted with all 24 strains of mycobacterium and 7C12 only reacted with H37Rv，H37Ra, M.bovis ，BCG strains, C2 and 7C12 re

7、acted with secreted proteins of H37Rv strain.40 000/38 000 antigen of H37Rv strain was expressed differently in Loewenstein-Jensen medium and Sauton liquid medium.Relative activity of all McAbs was between 10-410-7.The results of purified McAb showed that ammonium sulfate precipitation method could

8、have the highest rate of recovery.Ion exchange chromatography method could have the highest purity.Caprylic acid method can remove albumin effectively and the purification of McAbs in ascific fluid was simple and easy to perform.ConclusionsPolypeptide antigens of H37Rv against by C2, 7C12 McAb were

9、the secreted proteins.For purification of McAb，the results suggested that ion exchange chromatography method can be applied for analysis and caprylic acid method for a very large volume of ascitic fluid.【Key words】Monoclonal antibody；Mycobacterium；Mycobacterium tuberculosis當(dāng)前結(jié)核病研究的主要目的是鑒定、分離結(jié)核分支桿菌的免

10、疫保護(hù)因子、致病因子及用于血清學(xué)診斷的特異性抗原成份1-4。為此目的，我們應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)制備了結(jié)核分支桿菌H37Rv株菌體多種抗原的單克隆抗體雜交細(xì)胞株，用于分析抗原成份的特異性，篩選與結(jié)核特異性診斷相關(guān)的抗原成份。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)菌株及菌體抗原制備實(shí)驗(yàn)所用結(jié)核分支桿菌H37Rv株等24種分支桿菌菌株均購于衛(wèi)生部菌種保藏中心。將菌株分別接種于改良羅氏培養(yǎng)基上。另將H37Rv株接種于蘇通液體培養(yǎng)基上。37 培養(yǎng)13周，收集菌體于pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）中，80 水浴滅活2 h，菌懸液經(jīng)100 W超聲粉碎，-20 冷凍保存?zhèn)溆?。液體培養(yǎng)液經(jīng)硫酸銨沉淀分泌抗原，純化后-20 冷凍保

11、存?zhèn)溆?。二、單克隆抗體制備及雜交株的篩選用超聲粉碎的H37Rv株作為免疫抗原，按照Mauch等5的方法制備上述幾種主要抗原成份的單克隆抗體，首先用各抗原成份分別免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾臟與SP2/O小鼠骨髓細(xì)胞融合，融合細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)714 d，用ELISA方法篩選分泌抗體的雜交細(xì)胞株，經(jīng)Western 印跡法確認(rèn)后，對雜交細(xì)胞株進(jìn)行三次克隆化，產(chǎn)生的克隆細(xì)胞株一部分液氮凍存，一部分注入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水進(jìn)行單克隆抗體的特性分析。三、單克隆抗體特性分析1.單克隆抗體IgG亞類測定：用H37Rv株抗原包被酶標(biāo)板，加入待測單克隆抗體，再加入兔抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、Ig

12、G3 抗血清（丹麥DAKO公司產(chǎn)品，），37 放置1 h后，再加入羊抗兔Ig辣根過氧化物酶（Ig-HRP）抗血清（丹麥DAKO公司產(chǎn)品），用4-氯-1-萘酚顯色以確定IgG亞類。2單克隆抗體所抗抗原成份分子量測定：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫印跡技術(shù)測定抗原成份的相對分子質(zhì)量，詳細(xì)方法參見文獻(xiàn)6。3單克隆抗體相對親和力測定：詳細(xì)方法參見文獻(xiàn)7。4交叉反應(yīng)分析：采用免疫印跡技術(shù)和ELISA技術(shù)測定單克隆抗體與24種分支桿菌菌體抗原免疫交叉反應(yīng)結(jié)果及H37Rv株固體、液體培養(yǎng)菌體抗原之間的區(qū)別，分析分支桿菌之間抗原的同源性。四、單克隆抗體的純化采用硫酸銨法、辛酸法和DE

13、AE-SephadexA50離子交換柱層析法純化單克隆抗體，并對三種純化方法進(jìn)行了比較，詳細(xì)方法參見文獻(xiàn)8，9。結(jié)果一、單克隆抗體雜交株的建立分泌抗結(jié)核分支桿菌H37Rv株菌體抗原成份單克隆抗體的雜交細(xì)胞株，經(jīng)三次克隆化和多次傳代，得到14株穩(wěn)定的克隆細(xì)胞。二、單克隆抗體的特性分析1單克隆抗體生化特性：所產(chǎn)生的單抗分別抗H37Rv株菌體相對分子質(zhì)量76 000、65 000、60 000、45 000、40 000、28 000、16 000抗原成份，相對親和力均在10-410-7之間。2單克隆抗體與24種分支桿菌抗原成份的免疫交叉反應(yīng)：各單克隆抗體與24種分支桿菌抗原成份的免疫交叉應(yīng)可證明抗

14、原成份的特異性，其結(jié)果見表1。76 000、65 000、40 000/38 000多肽是分支桿菌的共同抗原成份。40 000/38 000多肽，除鳥分支桿菌不具有外，大多數(shù)分支桿菌都有。28 000、16 000多肽是結(jié)核分支桿菌、牛分支桿菌特有的抗原成份。60 000、45 000多肽存在于大多數(shù)致病性分支桿菌菌體中。表1各單抗與不同分支桿菌菌體抗原交叉反應(yīng)結(jié)果單抗H37Rv株H37Ra株牛分支桿菌BCG株鳥分支桿菌猿猴分支桿菌瘰癘分支桿菌偶然分支桿菌潰瘍分支桿菌胞內(nèi)分支桿菌堪薩斯分支桿菌海分支桿菌龜分支桿菌膿腫分支桿菌弋登分支桿菌黃色分支桿菌草分支桿菌地分支桿菌無色分支桿菌牡牛分支桿菌恥

15、垢分支桿菌次要分支桿菌迪氏分支桿菌斯氏分支桿菌C2+D3+-+1F6+-+-+-+-+1B8+-+-+-+-+1D4+-+-5B5+-+-+-+-+9H2+-+-+5A2+-+-+-+-+3F6+-+9H8+-+-+-+1C10+-+-7C12+-3單克隆抗體與H37Rv株固體、液體培養(yǎng)菌體抗原及分泌抗原反應(yīng)：各單克隆抗體與H37Rv株固體、液體培養(yǎng)菌體抗原反應(yīng)結(jié)果顯示，抗H37Rv株固體培養(yǎng)菌體76 000、40 000/38 000抗原單克隆抗體均不與H37Rv株液體培養(yǎng)菌體抗原反應(yīng)。14株單克隆抗體中只有C2、7C12與H37Rv株液體培養(yǎng)分泌抗原發(fā)生弱反應(yīng)。 三、單克隆抗體的純化我們采

16、用硫酸銨沉淀法、辛酸沉淀法和離子交換柱層析法從小鼠腹水中純化單克隆抗體，并對三種方法純化的單抗從純化濃度、純度、活性等方面進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，三種方法中硫酸銨法單抗回收率最高（39.7%），但是純度較差，不能完全去除白蛋白，對其它雜蛋白無去除作用。辛酸二步法單抗回收率較低（22.7%），這可能是由于實(shí)驗(yàn)步驟中的損耗造成的，但純化的單抗純度較高，可有效地去除白蛋白，對其它雜蛋白也有一定的去除作用。離子交換柱層析法回收率為30.2%，對單抗的純化程度最高，在純化物中幾乎無白蛋白和雜蛋白存在。三種純化方法對單抗活性無明顯影響。純化的單克隆抗體SDS-PAGE鑒定結(jié)果見1。1單克隆抗體純度SDS-P

17、AGE鑒定結(jié)果討論目前研究表明，在結(jié)核分支桿菌菌體中存在大約100多種蛋白抗原成分，相比較而言，研究比較清楚的結(jié)核分支桿菌抗原成分有6 000、10 000、12 000、16 000、19 000、24 000、35 000、38 000、45 000、65 000、71 000等相對分子質(zhì)量多肽成分，大約有10多種蛋白的抗原基因已被克隆，其中大多數(shù)克隆抗原具有一定的特異性和強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫反應(yīng)，包括16 000、19 000、24 000、35 000、38 000、45 000/47 000、53 000、71 000抗原等10-15。這些抗原在結(jié)核分支桿菌成份組成中只占極小一部分，

18、大多數(shù)抗原成份的功能和特性還不了解。我們制備的單抗分別抗H37Rv株76 000、65 000、60 000、45 000、40 000、28 000、16 000抗原成份，經(jīng)ELISA和免疫印跡技術(shù)分析，證明76 000、65 000、40 000/38 000多肽是分支桿菌的共同抗原成份，其中76 000多肽是結(jié)核分支桿菌H37Rv株的分泌型抗原成份。40 000/38 000多肽經(jīng)免疫印跡分析，其為結(jié)核分支桿菌H37Rv株固體培養(yǎng)菌體特有，6株抗40 000/38 000多肽的單抗均與H37Rv株液體培養(yǎng)菌體不發(fā)生反應(yīng)。76 000多肽也有相同結(jié)果，結(jié)果顯示結(jié)核分支桿菌H37Rv株在不同

19、培養(yǎng)條件下抗原的表達(dá)不同。28 000、16 000多肽是結(jié)核分支桿菌、牛分支桿菌特有的抗原成份，其中16 000多肽為分泌型抗原。60 000、45 000多肽存在于大多數(shù)致病性分支桿菌菌體中，是否與分支桿菌致病性有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。單抗純化是后續(xù)研究和開發(fā)的重要環(huán)節(jié)，從實(shí)驗(yàn)方法來看，辛酸二步法具有一次可處理大量腹水、無須特殊設(shè)備和試劑、所用試劑量小、方法簡便、一般實(shí)驗(yàn)室條件下即可完成等優(yōu)點(diǎn)，純化的單抗可應(yīng)用于對純度要求不是很高的實(shí)驗(yàn)，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。離子交換柱層析法適用于小批量高純度單抗的純化，實(shí)驗(yàn)對設(shè)備要求嚴(yán)格，操作相對比較煩瑣，比較適宜用于分析，雖然Sephadex A50價

20、格較貴，但柱子可以再生反復(fù)使用，也可降低成本。因此，我們認(rèn)為對單抗的純化要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)對單抗純度的要求而定。在純度要求不高，提取量大的情況下，化學(xué)提純法方便實(shí)用；當(dāng)純度要求較高時，柱層析法較適宜?；痦?xiàng)目：衛(wèi)生部青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目陸學(xué)東(710068 西安，陜西省人民醫(yī)院老年病研究中心)張小艷(710068 西安，陜西省人民醫(yī)院老年病研究中心)張銀輝(710068 西安，陜西省人民醫(yī)院老年病研究中心)參考文獻(xiàn)1，Harth G，Lee BY，Wang J，et al.Novel insights into the genetics，biochemistry and immuno-cytoch

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