項目實訓(xùn)手冊-項目7-三文魚中副溶血性弧菌檢驗

1、農(nóng)產(chǎn)品微生物檢驗技術(shù)課程實訓(xùn)指導(dǎo)手冊項目七 三文魚中副溶血性弧菌檢驗（依據(jù)GB 4789.72013副溶血性弧菌檢驗）一、實訓(xùn)目的掌握副溶血性弧菌的特征與生物學特性，副溶血性弧菌國標檢驗方法及檢驗操作程序，明確副溶血性弧菌檢驗操作要點，熟練使用干制生化鑒定試劑盒和API 20E試紙條進行生化鑒定。二、實訓(xùn)原理采用選擇性培養(yǎng)基對目標菌進行增菌培養(yǎng)，然后生化鑒定進行定性或定量檢驗。對于農(nóng)產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測主要是將培養(yǎng)分離后的菌落通過菌落形態(tài)觀察、菌體形態(tài)觀察、初步生化鑒定及確定生化鑒定實驗進行鑒別和判定。三、實訓(xùn)要求本項目樣品中副溶血性弧菌檢驗依據(jù)GB 4789.7-2013食品安全國家標準

2、 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗進行檢驗操作以及按照GB 29921-2013食品安全國家標準 食品中致病菌限量進行評價。本項目全面考察學生依據(jù)國標對樣品中副溶血性弧菌進行定性或定量檢驗的能力，實施過程均可分成檢驗準備、檢驗操作、結(jié)果與報告四個部分。定性與定量檢驗的操作鑒定操作部分相同，均包括增菌、分離、純培養(yǎng)、初步鑒定、確定鑒定5個步驟。本項目按4人/組為單位進行操作，要求在實驗室完整進行樣品中副溶血性弧菌的檢驗。四、實驗材料和設(shè)備 1 試劑和溶液2.1選擇性增菌試劑3氯化鈉堿性蛋白胨水；2.2分離平板硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂平板、弧菌顯色培養(yǎng)基；注意：這兩種選擇

3、性培養(yǎng)基均不可過度加熱；使用前一天配制，且在48h內(nèi)使用；傾注平板前需搖勻；不能反復(fù)溶解，平板需避光保存于室溫環(huán)境；2.3純化平板3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂；2.4初步鑒定生化試劑氧化酶試劑、革蘭氏染色液、3氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂斜面、3%氯化鈉半固體培養(yǎng)基、嗜鹽性試驗培養(yǎng)基；2.5確定鑒定生化試劑3氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基、3氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、3氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基、Voges-Proskauer（V-P）試劑、3氯化鈉溶液、ONPG試劑；2.6系統(tǒng)生化鑒定試劑副溶血性弧菌干制生化鑒定試劑盒（包括3%氯化鈉三糖鐵（TSI）、3%氯化鈉半固體、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、無鹽胨水

4、、6%鹽胨水、8%鹽胨水、10%鹽胨水、氨基酸對照、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、V-P、ONPG及輔助試劑（無菌石蠟、V-P甲、乙液試劑、糖發(fā)酵添加劑）、API20E生化鑒定試劑條及其輔助試劑（無菌石蠟、TDA試劑、JAMES試劑、V-P甲、乙液試劑）2 儀器和設(shè)備2.1實驗設(shè)備天平、均質(zhì)器、超凈工作臺、生物安全柜、顯微鏡、恒溫恒濕培養(yǎng)箱；2.2實驗用具無菌吸管、微量移液器及吸頭、無菌手術(shù)剪、鑷子、接種環(huán)。五、實訓(xùn)任務(wù)（包含結(jié)果計算）定性檢驗1、樣品制備在無菌室內(nèi)，以75%酒精擦拭外包裝，尤其是包裝開口處，用無菌剪刀在樣品封口處剪開外包裝，換一個無菌剪刀，將三文魚樣品剪碎至無菌罐中，用無菌鑷子夾取

5、并稱取25 g樣品至盛有3%氯化鈉堿性蛋白胨水225 mL中，轉(zhuǎn)入注明樣品信息、檢測人員以及檢測日期的均質(zhì)袋中，密封，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min。若樣品為液態(tài)，不需均質(zhì)，振蕩混勻即可；魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓；貝類取全部內(nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個動物，或者動物的中心部分，包括腸和鰓；如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應(yīng)部分；3%氯化鈉堿性蛋白胨水為選擇性增菌液，其高濃度鹽含量可抑制除嗜鹽微生物外的其他微生物生長。均質(zhì)完畢的樣品通過傳遞窗出無菌室，清理無菌室，打開無菌室紫外燈，輻照滅菌30 min。非冷凍樣品

6、采集后應(yīng)立即置7 10 冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應(yīng)在45 以下不超過15 min或在2 5 不超過18 h解凍。將上述均質(zhì)完成的檢測樣品置于預(yù)先設(shè)置36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h18 h。2、分離病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在BSL-2實驗室生物安全柜中進行。用接種環(huán)在距離增菌液液面以下1 cm 內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，分別劃線接種TCBS瓊脂平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上。本片將分別演示這兩種平板的分離現(xiàn)象。接種完成后，置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h24 h，待觀察。副溶血型弧菌在TCBS瓊脂平板上培養(yǎng)一般不超過24 h，隨培養(yǎng)時間的延長，一些非目標菌（如霍亂）代謝產(chǎn)生的酸會不斷

7、揮發(fā)，同時代謝蛋白胨產(chǎn)生一定的堿性物質(zhì)，兩者綜合導(dǎo)致菌落由黃色逐漸向藍綠色轉(zhuǎn)變，從而引起誤判現(xiàn)象。所以應(yīng)盡快（不超過1h）挑取菌落或作標記；副溶血性弧菌在各分離平板上的菌落特征如下:TCBS瓊脂平板上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2 mm3 mm；弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說明進行判定，使用法國科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，現(xiàn)象為紫紅色。3、純培養(yǎng)用接種環(huán)挑取TCBS瓊脂平板或弧菌顯色培養(yǎng)平板上3個或以上可疑菌落劃線接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板。挑取可疑菌落時可以選擇其中一種平板上的菌落，也可以兩種都挑取。置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18

8、h24 h，待后續(xù)鑒定實驗。4、初步鑒定副溶血性弧菌的初步鑒定包括氧化酶試驗、革蘭氏染色試驗、三糖鐵（TSI）試驗、動力試驗以及嗜鹽性試驗。氧化酶試驗：用接種環(huán)（或一次性接種環(huán)）挑取純培養(yǎng)單菌落于氧化酶安瓿瓶中，在1 min內(nèi)觀察現(xiàn)象，不變色者為陰性，呈現(xiàn)紫色為陽性。革蘭氏染色試驗：取潔凈載玻片，于其上滴加一滴生理鹽水，用接種環(huán)將可疑菌落涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。三糖鐵（TSI）試驗：用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的單菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面，先在斜面劃線，再于底層穿刺，置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀

9、察結(jié)果。本片三糖鐵（TSI）試驗結(jié)果為：底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深。三糖鐵培養(yǎng)基含有葡萄糖、蔗糖和乳糖等三種可發(fā)酵的碳源，這些碳源被菌體利用產(chǎn)酸，可使酚紅指示劑變色。某些菌能還原Na2S2O3產(chǎn)生H2S，與硫酸亞鐵銨反應(yīng)生成黑色的FeS，而使培養(yǎng)基變黑。動力試驗：用接種針挑取純培養(yǎng)單菌落，穿刺半固體動力培養(yǎng)基，置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。本片動力試驗結(jié)果為：沿動力培養(yǎng)基中穿刺線擴散生長，有動力；嗜鹽性試驗：用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的單菌落，分別接種 0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，置于36 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察液體混濁情況。本片嗜鹽

10、性試驗結(jié)果為：待檢菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在6%氯化鈉和 8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。根據(jù)以上初步鑒定結(jié)果可初步判斷為可疑副溶血性弧菌屬，需進一步做生化鑒定。5、確定鑒定檢測工作中，由于副溶血性弧菌與其他弧菌生化性狀相似，且易存在個別變體，可根據(jù)初步鑒定結(jié)果，從3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙海褂蒙b定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行確定鑒定。1） 干制生化鑒定試劑盒采用某品牌干制生化鑒定試劑盒，該試劑盒包括三糖鐵、半固體、鹽胨水、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、賴氨酸脫羧酶及其對照、鳥氨酸及其對照、精氨酸及其對

11、照、V-P、ONPG共12項生化試驗試劑，通過接種可疑菌落懸濁液培養(yǎng)一定時間后，觀察生化現(xiàn)象，結(jié)合標準判定鑒定結(jié)果。另外，由于生化鑒定試劑盒不包括氧化酶試驗，且試劑盒中的適配三糖鐵與動力試驗現(xiàn)象不明顯，一般將這三個試驗單獨操作，其他生化指標采用生化鑒定試劑盒完成。按照產(chǎn)品說明書操作，主要操作步驟如下：a) 第一步：從鋁箔袋中取出試劑盒，打開盒蓋；b) 第二步：用接種針從平板上挑取新鮮培養(yǎng)的適量單菌落接至適量無菌水中，與試劑盒中的標準比濁管進行比對，制成0.5麥氏菌懸液，注意菌懸液濃度不宜過大，否則可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果；c) 第三步：用一次性滴管分別滴加一滴糖發(fā)酵添加劑于葡萄糖、蔗糖、乳糖三個帶有

12、“”試驗孔中；d) 第四部：在所有的生化項目孔中加入0.2 mL制備的菌懸液；e) 第五步：在氨基酸對照、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸中滴加2滴礦物油覆蓋培養(yǎng)基表面，蓋上盒蓋；f) 第六步：與三糖鐵、動力生化管一同置于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，其中ONPG實驗培養(yǎng)1-3h觀察結(jié)果，如為陰性繼續(xù)培養(yǎng)至24h觀察結(jié)果；g) 第七步：培養(yǎng)后，在VP試驗孔中滴加VP甲液3滴，乙液1滴，10-30min內(nèi)觀察結(jié)果。本次實驗結(jié)果觀察如下：蔗糖藍綠色為陰性、葡萄糖黃色為陽性、甘露醇黃色為陽性、分解葡萄糖產(chǎn)氣陰性、乳糖藍綠色為陰性、硫化氫陰性、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸對照管黃色，試驗管紫色為陽性、精氨酸對照

13、管和試驗管都黃色為陰性，V-P不變色為陰性、ONPG無色為陰性。判定：根據(jù)標準描述本實驗結(jié)果為典型反應(yīng)，判定為副溶血性弧菌。2） API 20E生化鑒定試劑條副溶血性弧菌與其他弧菌生化性狀相似，且易存在個別變體，實際檢測工作中常使用能夠通過查取編碼表或軟件判讀方式的法國梅里埃公司API 20E生化鑒定試劑條進行生化鑒定，以保證副溶血性弧菌檢驗的準確性。API 20E試劑條根據(jù)快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測技術(shù)發(fā)展的一種細菌編碼鑒定法，廣泛應(yīng)用于臨床、食品中革蘭氏陰性桿菌的快速鑒定。由于該試劑條判定結(jié)果時需結(jié)合氧化酶實驗，而試劑條中無該反應(yīng)孔，故需補做氧化酶實驗。按照產(chǎn)品說明書，操作步驟如下：a)

14、 第一步：打開梅里埃3 mL 0.85%NaCl安瓿瓶，從分離平板上挑取適量單個分純菌落至該培養(yǎng)基，仔細研勻，制成0.5麥氏生物菌懸液；b) 第二步：用吸管將菌懸液加入到試條的小管內(nèi)（為避免在小管基底部形成氣泡，將試條輕微向前傾斜，并將吸管緊靠小杯邊緣加入菌液），在CTT、VP、GEL小管（帶有“”實驗孔中），菌液需充滿底部和杯部，其他管僅充滿管部（不是杯部）；c) 第三步：在實驗ADH、LDC、ODC、H2S和URE小杯內(nèi)（帶有“ ”實驗孔中）加入礦物油以形成厭氧環(huán)境；d) 第四步：蓋上培養(yǎng)盒，于36 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 h；e) 第五步：進行氧化酶實驗，用一次性接種環(huán)挑取至單

15、菌落氧化酶試劑中，在1分鐘內(nèi)菌落不變色者為陰性，呈現(xiàn)紫色為陽性，本實驗菌落不變色，氧化酶實驗為陰性。進行結(jié)果觀察與判讀：a) 在TDA反應(yīng)孔中滴加1滴TDA試劑，即刻觀察結(jié)果；b) 在IND反應(yīng)孔中滴加1滴JAMES試劑，即刻觀察結(jié)果；c) 在VP反應(yīng)孔中滴加1滴VP1和VP2試劑，等待10分鐘觀察結(jié)果；d) 觀察其他反應(yīng)孔的顏色變化，判讀結(jié)果，記錄在試劑盒提供的結(jié)果報告單上，每3個試驗為一組，每個陽性試驗分別賦予數(shù)值1,2,4，在每組中陽性反應(yīng)以相應(yīng)的數(shù)值相加。由此可得到7位數(shù)字的編碼，氧化酶反應(yīng)構(gòu)成第21個試驗。 獲得編碼后可根據(jù)鑒定檢索手冊，從中查找數(shù)值編碼，也可根據(jù)APIweb TMM

16、或ATBTM new鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。判定：通過ATBTM new鑒定軟件，鑒定結(jié)果。如下圖，副溶血性弧菌API 20E檢驗為極好的鑒定，%ID99.9，T值1.0。另外，在副溶血性弧菌鑒定還可以進行血清學分型以及檢測致病性的神奈川（kanagawa）試驗。副溶血性弧菌有845個血清型，主要通過十三種耐熱的菌體抗原（即O抗原）鑒定，而七種不耐熱的包膜抗原（即K抗原）可以用來輔助鑒定。其致病力可用神奈川（kanagawa）試驗來區(qū)分。副溶血性弧菌能使人或家兔的紅細胞發(fā)生溶血，在瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)溶血帶，稱為“神奈川試驗”陽性。6、結(jié)果與報告綜合以上初步生化與確定生化鑒定結(jié)果，報告25 g（mL

17、）樣品中檢出或未檢出副溶血性弧菌。本實驗分離平板上菌落特征典型，生化鑒定為可疑副溶血性弧菌，報告25 g樣品檢出。填寫原始記錄單和報告。注意：檢驗結(jié)果報告后，被檢樣品方能處理。檢出致病菌的樣品要經(jīng)過無害化處理。定量檢驗副溶血性弧菌定量檢驗與定性檢驗相比，在進行增菌時主要增加了一步接種至適宜3個連續(xù)稀釋度3%氯化鈉堿性蛋白胨水試管（每個稀釋度接種3管）步驟，其后的分離、純化及鑒定程序與定性檢驗完全一致，最后根據(jù)9支稀釋試管中副溶血性弧菌陽性管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表進行樣品中副溶血性弧菌數(shù)量報告。檢驗操作：a） 編號：用記號筆在盛有生理鹽水的樣品均質(zhì)袋中和無菌試管上作稀釋度標記，分離純化和

18、鑒定用的平皿均需編號清晰，編號內(nèi)容包括樣品稀釋度、平板名稱、接種物名稱、實驗時間、操作人員等；b） 稀釋：用移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，注入含有9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1:100的樣品勻液，更換吸頭，按上述操作程序，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支無菌吸頭；c） 選擇稀釋度：根據(jù)對檢樣污染情況的估計，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種 3 支含有 9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種 1 mL，本次實驗選擇1:10、1:100、1:1000三個濃度樣品勻液；d） 增菌培養(yǎng)：將接種完成的三個濃度梯度的9支試管，置 36 培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 8 h18 h；e） 分離：增菌完成后，觀察9支試管，其中增菌液渾濁為疑似陽性管，本次實驗1:10稀釋度有3支增菌液渾濁，顯示生長、1:100稀釋度有1支顯示生長、1:1000無顯示生長。將所有顯示生長的增菌液，劃線TCBS顯色培養(yǎng)基平板，一支試管劃線一塊平板，置于36 培養(yǎng)箱培養(yǎng)1824 h。后續(xù)鑒定步驟同定性檢驗。 f） 查表判定：根據(jù)初步鑒定與確定鑒定，確定疑似陽性管中的陽性管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。六、原始數(shù)據(jù)記錄表副溶血性弧菌檢驗原始記錄樣品編號樣品名稱檢測地點302微生物室檢驗方法 GB 4789