低強(qiáng)度紅激光局部照射影響血管損傷后重塑的實(shí)驗(yàn)研究

1、    低強(qiáng)度紅激光局部照射影響血管損傷后重塑的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】目的評(píng)價(jià)低能量紅激光局部照射(LPRLI)對(duì)血管損傷后重塑模式的影響。方法雄性新西蘭白兔100只，隨機(jī)分為球囊拉傷組和球囊拉傷加激光照射組。球囊拉傷右髂動(dòng)脈后，應(yīng)用激光球囊照射拉傷局部，總的能量密度為0.9 J/cm2。分別于術(shù)后3天、1周、2周、4周和8周分批處死動(dòng)物，原位固定后截取病變血管進(jìn)行病理組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。最后1批動(dòng)物在取材前進(jìn)行髂動(dòng)脈造影。結(jié)果拉傷后3天單純拉傷組管腔橫截面積

2、和外彈力板圍繞面積明顯低于激光照射組，管腔狹窄程度顯著高于激光照射組(P0.05)；單純拉傷組術(shù)后2周血管腔橫截面積和外彈力膜圍繞面積與術(shù)后3天相比有所增大(P0.05)，血管狹窄程度減輕(P0.05)，術(shù)后28周血管腔橫截面積和外彈力膜圍繞面積均進(jìn)行性減小，狹窄程度逐漸加重(P0.05)。在8周時(shí)已顯著小于正常血管外彈力膜圍繞面積(P0.05)。激光組術(shù)后28周血管狹窄程度無明顯變化(P0.05)，外彈力膜圍繞面積進(jìn)行性增大，到術(shù)后8周已顯著大于正常血管的外彈力板圍繞面積(P0.05)。術(shù)后1周內(nèi)膜加中膜面積兩組均出現(xiàn)明顯增厚(P0.05)，從第2周開始，激光組內(nèi)膜加中膜面積顯著小于單純拉傷

3、組(P0.05)。髂動(dòng)脈造影結(jié)果顯示，單純拉傷組血管最小內(nèi)徑明顯小于激光照射組(P0.01)；激光照射后血管狹窄程度顯著減輕(P0.01)。結(jié)論激光局部照射可以顯著改善血管損傷后重塑的建立模式，減少狹窄的發(fā)生?！娟P(guān)鍵詞】低強(qiáng)度紅激光再狹窄重塑 The role of low power red laser illumination on remodeling after arterial injury in normal rabbitsLi Guang, Chen Jiyan, Zhou Yingling, et al.（Guangdong Provincial Cardiovascular

4、Institute, Guangzhou 510100）【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of a certain density illumination of low power red laser on the remodeling after arterial injury. MethodOne hundred male New Zealand white rabbits were randomized into two groups: balloon injury group (control group) and ballo

5、on injury followed by laser illumination group (treatment group: total illumination density:0.9 J/cm2). To study the time course of morphological changes, all the animals were killed on 3,7,14,28 or 56 days respectively after the procedure and with local fixation the iliac arteries were harvested fo

6、r further pathomorphometrical analysis. At the end of 56 days, animals received angiography before killed. ResultsUnder microscope, the scores of iliac arterial injury were similar between the two groups( P0.05). On the third day after the procedure, recoils were seen in both groups, but the stenosi

7、s rate of balloon group were significantly higher than those of laser group (P0.05). The areas embayed by extral elastic membrane were altered synchronously with the lumen areas and it was smaller of balloon group than of laser group (P0.05). At the end of 2 weeks, the areas under extral elastic mem

8、brane in balloon group increased obviously compared with those of the normal arteries and the stenosis rate reduced compared with those on third day (P0.05). From 14 to 56 days, the areas of lumen and under extral elastic membrane were both reduced increasingly in balloon group and at the end of 56

9、days the later was smaller significantly than those of normal arteries. In laser group, the lumen areas showed no changes through the whole time but the areas embayed by extral elastic membrane increased gradually and at the end of 56 days they were significantly larger than those of normal arteries

10、. At the end of 56 days, the stenosis rate was significant higher in balloon group than those in laser group (P0.05). Iliac arterial angiography showed the minimal lumen dia-meters and lumen stenosis rates in laser group were significantly improved compared with those in balloon group (P0.01). Concl

11、usionLow power laser illumination in a certain density followed arterial injury could significantly improve the mode of arterial remodeling and reduce the arterial stenosis degrees after balloon injury.【Key words】Low power red laser Restenosis Remodeling血管重塑在經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈成形術(shù)(PTCA)后再狹窄的形成中的作用越來越受到重視，而血管損傷后內(nèi)

12、皮細(xì)胞的剝脫和修復(fù)障礙對(duì)血管重塑模式的建立有著重要影響1。低強(qiáng)度紅激光照射(low power red laser illumination, LPRLI)具有促進(jìn)細(xì)胞的再生和損傷組織修復(fù)作用2，一定能量密度的LPRLI可以促進(jìn)EC的增殖和功能恢復(fù)3。本文旨在評(píng)價(jià)LPRLI對(duì)血管損傷后重塑模式建立的影響。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料雄性新西蘭白兔100只，體重2.53.0 kg。激光球囊導(dǎo)管(3.0 mm×20 mm. Global Therapeutic)、激光發(fā)生器(He-Ne Laser. Global Therapeutic)、普通PTCA導(dǎo)引鋼絲和球囊導(dǎo)管(Medtronic 3

13、.0 mm×10 mm)、電腦像分析儀(Knotron IBAS 2.0)、Philips BC 3000雙C臂心血管造影機(jī)。二、實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組按照完全隨機(jī)的方法將兔子分為單純球囊拉傷組和球囊拉傷加激光照射組各50只。每組動(dòng)物按照取材時(shí)間隨機(jī)分成5個(gè)亞組：術(shù)后3天、1周、2周、4周和8周，每個(gè)亞組各10只。于拉傷前1周開始給予高脂飲食(5%的豬油、2%的膽固醇、其余為標(biāo)準(zhǔn)綜合飼料)，術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)直到處死。1單純拉傷組血管形態(tài)學(xué)變化2激光照射組血管形態(tài)學(xué)變化2.球囊拉傷與紅激光照射應(yīng)用PTCA球囊導(dǎo)管將家兔髂動(dòng)脈拉傷后，插入激光球囊導(dǎo)管(采用帶有200 m光纖和頭端可以同軸輻

14、射樣發(fā)射激光的球囊導(dǎo)管，3.0 mm×20 mm)，使球囊位于髂動(dòng)脈拉傷處。維持壓力2atm，開通激光，輸出功率10 mW，照射60秒后，關(guān)閉激光并抽空球囊。1分鐘后重復(fù)上述照射過程兩次。每次持續(xù)照射1分鐘，間隔一分鐘。照射總的能量密度均為0.9 J/cm2。單純拉傷組的處理除不進(jìn)行激光照射外，其他與照射組相同。3.造影與病理組織學(xué)檢查(1)造影：拉傷后8周經(jīng)左頸總動(dòng)脈切開，沿導(dǎo)絲插入4F普通右心導(dǎo)管到腹主動(dòng)脈進(jìn)行髂動(dòng)脈造影檢查，并用電影膠片進(jìn)行記錄。采用造影機(jī)電腦自帶軟件測(cè)定鄰近正常血管腔內(nèi)徑、管腔最小內(nèi)徑和狹窄程度(與鄰近正常管腔相比)，連續(xù)測(cè)量3次，計(jì)算平均值。(2)病理組織學(xué)

15、檢查：分別于拉傷后3天、1周、2周、4周和8周進(jìn)行髂動(dòng)脈病理組織學(xué)檢查。采用10%甲醛溶液原位固定髂動(dòng)脈的方法4，留置血管標(biāo)本并進(jìn)行HE、彈力纖維染色和平滑肌-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和計(jì)算機(jī)像分析系統(tǒng)分析測(cè)定：管腔面積、內(nèi)膜加中膜面積(外彈力板與管腔之間)和外彈力板圍繞面積(包括管腔、內(nèi)膜和中膜)，計(jì)算血管狹窄程度(與鄰近正常血管相比)，血管損傷程度參考Schneider方法進(jìn)行評(píng)分5。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組之間的數(shù)據(jù)(±s）分析采用成組t檢驗(yàn)、方差分析和完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分析方法，以P值小于0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果單純拉傷組1只和激光照射組3只兔因球囊拉傷時(shí)血管破

16、裂死亡，另有1只兔因拉傷血管處血栓形成而閉塞。其余95只兔成功建立了動(dòng)物模型并進(jìn)行到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。一、病理形態(tài)學(xué)分析病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果見附表。兩組血管壁損傷程度積分相似(P0.05)；鄰近正常血管的管腔橫截面積兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。平滑肌-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體染色顯示血管中膜和增生的內(nèi)膜充填的細(xì)胞漿呈棕黃色，表明主要的細(xì)胞成分為VSMC。拉傷后3天兩組血管管腔橫截面積和外彈力板圍繞面積均出現(xiàn)明顯減小，并且單純拉傷組管腔橫截面積和外彈力板圍繞面積明顯低于激光照射組(P0.05)，管腔狹窄程度顯著高于激光照射組(P0.05)；單純拉傷組術(shù)后2周血管腔橫截面積與術(shù)后3天相比有所增大(P0.05

17、)，血管狹窄程度減輕(P0.05)，術(shù)后28周血管腔橫截面積進(jìn)行性減小，狹窄程度逐漸加重(P0.05)。單純拉傷組術(shù)后2周外彈力膜圍繞面積與正常血管相比顯著增大(P0.05)，術(shù)后28周外彈力膜圍繞面積出現(xiàn)減小趨勢(shì)，在8周時(shí)已顯著小于正常血管外彈力膜圍繞面積(P0.05)。激光組術(shù)后28周血管狹窄程度無明顯變化(P0.05)，外彈力膜圍繞面積進(jìn)行性增大，到術(shù)后8周已顯著大于正常血管的外彈力板圍繞面積(P0.05)。術(shù)后1周內(nèi)膜加中膜面積兩組均出現(xiàn)明顯增厚(P0.05)，并呈進(jìn)行性的加重。但是，從第2周開始兩組間內(nèi)膜加中膜面積顯示明顯差異(P0.05)，激光組內(nèi)膜加中膜面積顯著小于單純拉傷組(P

18、0.05)，并且兩組間內(nèi)膜加中膜面積的差別隨時(shí)間逐漸擴(kuò)大。附表病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果(mm2)時(shí)間項(xiàng)目3天1周2周4周8周拉傷(n=9)激光(n=9)激光(n=9)拉傷(n=9)激光(n=9)拉傷(n=9)激光(n=9)拉傷(n=10)拉傷(n=9)激光(n=9)正常管腔面積*1.43±0.371.41±0.421.40±0.291.43±0.331.42±0.271.42±0.361.39±0.301.40±0.281.43±0.371.42±0.26管腔面積0.98±0.231.28&

19、#177;0.271.06±0.271.32±0.261.25±0.341.33±0.390.73±0.241.30±0.320.32±0.131.28±0.21管腔狹窄程度%38.75±6.428.67±1.7524.57±5.147.49±2.3611.28±2.436.08±1.5449.29±5.427.26±2.1376.53±9.629.64±3.88內(nèi)膜+中膜面積0.42±0.14*0.41&

20、#177;0.20*0.49±0.19*0.48±0.23*0.72±0.340.54±0.270.95±0.480.62±0.251.25±0.450.76±0.37正常外彈力膜下面積*1.82±0.261.83±0.321.81±0.351.82±0.301.78±0.261.82±0.331.79±0.241.83±0.321.82±0.221.81±0.27外彈力膜下面積1.40±0.281.69&

21、#177;0.361.55±0.421.80±1.401.97±0.39*1.87±0.31*1.68±0.381.92±0.411.57±0.442.04±0.39血管損傷程度評(píng)分*2.50±0.712.40±0.522.50±0.532.40±0.702.44±0.762.33±0.502.40±0.522.60±0.702.57±0.732.44±0.53注：*組間無顯著性差異P0.05;組間有顯著性差異P0.

22、05;與正常相比有顯著性差異P0.05。 二、血管造影定量分析術(shù)后第8周，髂動(dòng)脈造影結(jié)果顯示，鄰近正常血管內(nèi)徑兩組間無顯著性差異(1.52±0.21 vs 1.48±0.17, P0.05)。單純拉傷組血管最小內(nèi)徑明顯小于激光照射組(0.57±0.17 vs 1.32±0.22, P0.01)；與鄰近正常血管相比，狹窄程度兩組間存在顯著差異，激光照射后血管狹窄程度顯著減輕(62.02%±13.23% vs 11.62%±8.24%，P0.01)。討論一、LPRLl對(duì)血管重塑的影響以往對(duì)預(yù)防血管再狹窄的研究主要是針對(duì)于抑制VSMC的遷移

23、和增生，減少再狹窄的發(fā)生，但是效果并不理想。病理學(xué)和血管內(nèi)超聲研究發(fā)現(xiàn)，與單純內(nèi)膜VSMC的增生相比，血管的病理性重塑在再狹窄的發(fā)生機(jī)制中占有更重要的地位6。為了研究LPRLI對(duì)血管重塑的影響，我們分為5個(gè)不同的時(shí)間段，動(dòng)態(tài)觀察血管拉傷后重塑的形成情況以及LPRLI的影響。在血管取材時(shí)，采用在體同等壓力灌注原位固定的方式4，確保病變血管保持原有在體時(shí)的形態(tài)，盡量減少因?yàn)槿〔暮筒±順?biāo)本制作造成血管的變形，以便于進(jìn)行血管形態(tài)學(xué)的分析。在進(jìn)行計(jì)算機(jī)形分析時(shí)，測(cè)定血管外彈力膜圍繞面積作為整個(gè)血管的橫截面積，以其變化來反映血管形態(tài)學(xué)的重塑情況。以外彈力膜圍繞面積減去管腔面積作為內(nèi)膜加中膜面積，來反映VS

24、MC的增生程度。結(jié)果顯示，在拉傷后3天，單純拉傷組血管腔面積縮小了38.75%，而激光照射組管腔面積只減少16.59%，兩組間存在顯著的差異。但是此時(shí)內(nèi)膜加中膜面積兩組間沒有顯著性差別，與鄰近正常血管壁相比，也沒有明顯的增厚。相反整個(gè)外彈力板下的面積兩組均出現(xiàn)減小，與管腔面積減小的幅度相似。表明拉傷后血管舒張發(fā)生障礙，血管發(fā)生了回縮，而LPRLI對(duì)這種回縮起到了抑制作用。在拉傷后第2周，單純拉傷組血管內(nèi)膜出現(xiàn)了顯著的增厚，管腔面積雖然小于正常血管腔面積，但是與第1周相比，狹窄程度反而減輕，外彈力膜圍繞面積與正常血管相比，呈現(xiàn)出明顯的擴(kuò)大，血管發(fā)生了適應(yīng)性的重塑。以后的4周和8周的病理組織學(xué)檢測(cè)

25、顯示單純拉傷組血管內(nèi)膜加中膜面積進(jìn)行性增大，管腔面積進(jìn)行性減小，同時(shí)外彈力板下面積也呈現(xiàn)出逐漸減小的趨勢(shì)，到術(shù)后8周時(shí)已顯著小于正常血管的外彈力膜圍繞面積，整個(gè)血管由適應(yīng)性重塑轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇灾厮墁F(xiàn)象。激光照射組在拉傷后第2周管腔面積與第1周相比沒有顯著性差異，外彈力膜下面積出現(xiàn)增大趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)顯著性。在28周的時(shí)間內(nèi)，激光照射組同樣出現(xiàn)血管內(nèi)膜加中膜面積逐漸增厚，增厚程度顯著小于單純拉傷組，更重要的是激光照射后血管管腔面積隨時(shí)間沒有明顯的變化，外彈力板下面積卻逐漸增大，并在第8周時(shí)已明顯大于正常血管的外彈力膜下面積，血管表現(xiàn)出一種緩慢的適應(yīng)性重塑。與單純拉傷組相比，兩組血管外彈力膜圍繞

26、面積的動(dòng)態(tài)變化曲線出現(xiàn)了顯著的差異，因此，我們推測(cè)LPRLI改變了損傷血管重塑的建立模式，抑制了血管的病理性重塑或者是促進(jìn)了血管的適應(yīng)性重塑，這是以往在預(yù)防再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究中很少注意到的現(xiàn)象。血管造影顯示術(shù)后第8周激光照射組血管最小內(nèi)徑顯著大于單純拉傷組，血管狹窄程度明顯減輕，與病理形態(tài)學(xué)分析結(jié)果一致，從不同角度表明了LPRLI對(duì)血管損傷后狹窄的預(yù)防作用。二、LPRLI預(yù)防再狹窄機(jī)制的初步探討過去，低強(qiáng)度激光照射主要用于促進(jìn)創(chuàng)傷后或皮膚粘膜潰瘍的組織修復(fù)。后來，John和Kipshidze等7，8研究發(fā)現(xiàn)LPRLI后VSMC的非內(nèi)皮依賴性的收縮功能明顯受到抑制，細(xì)胞發(fā)生變性壞死，而局部的溫度改

27、變只在1.2以內(nèi)，因此可以完全排除激光的熱損傷。在進(jìn)一步的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一定能量密度(1.5 J/cm2)的LPRLI可以通過抑制和殺傷VSMC，顯著減少血管成形術(shù)后再狹窄的發(fā)生。但是過量的VSMC的破壞可能會(huì)形成局部的血管瘤；另外，過多的VSMC破壞后可以釋放出大量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，引起殘存的和損傷周圍的VSMC的遷移和增生，從而影響紅激光的療效。Kipshidze進(jìn)一步應(yīng)用不同能量密度的He-Ne紅激光照射離體培養(yǎng)的兔和人的VSMC和EC9，當(dāng)照射的能量密度在1.0 J/cm2以下時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性增強(qiáng)，生長(zhǎng)和增殖加快，但是VSMC的活性并沒有明顯的改變。增加照射的能量密度，首

28、先表現(xiàn)出EC的活性受到抑制，說明EC與VSMC相比對(duì)LPRLI更敏感。此外，Kara的研究表明，低能量密度的紅激光照射可以顯著地提高EC的黏附能力，這對(duì)于EC的增生和修復(fù)是至關(guān)重要的。在以上研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了血管損傷后局部給予更低能量密度的紅激光照射(0.9 J/cm2)的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示LPRLI可明顯減少血管損傷后早期的收縮反應(yīng)，抑制VSMC的增生和血管壁的肥厚，改善血管損傷后重塑的建立模式。通過以上三種作用，綜合結(jié)果是LPRLI顯著減少了血管損傷后的狹窄程度。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，激光照射后中膜VSMC的壞死程度與單純拉傷組相似。表明以能量密度為0.9 J/cm2的紅激光局部照

29、射對(duì)血管平滑肌細(xì)胞沒有直接的殺傷作用。術(shù)后3天激光組血管的回縮受到抑制，而此時(shí)EC尚未能得到足夠的修復(fù)，因此這種對(duì)血管回縮的抑制作用與內(nèi)皮依賴性的舒張無關(guān)?？赡苁堑蛷?qiáng)度激光照射對(duì)VSMC起到了直接舒張作用、抑制了血管損傷后的反應(yīng)10。低強(qiáng)度紅激光照射后如何抑制損傷血管VSMC的增生，以及通過何種途徑來改變血管重塑的模式尚不清楚。根據(jù)以往的研究結(jié)果，血管成形術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞的及時(shí)修復(fù)和功能恢復(fù)對(duì)預(yù)防再狹窄的發(fā)生起著重要的作用3。一方面，內(nèi)皮的修復(fù)可減少血液中活性物質(zhì)對(duì)VSMC的直接刺激作用，并可減少局部小血栓的形成；另一方面，修復(fù)的EC可合成NO等活性物質(zhì)，擴(kuò)張局部血管，有利于適應(yīng)性重塑的建立。而且

30、，NO還對(duì)VSMC的遷移和增生具有直接抑制作用11。血管成形術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞的剝脫很少是完全性的，往往存在著島狀的內(nèi)皮細(xì)胞。因此，我們推測(cè)血管損傷后給予低能量密度的紅激光局部照射可能會(huì)通過促進(jìn)殘存的和損傷周邊的內(nèi)皮細(xì)胞的再生和功能修復(fù)，來抑制VSMC的遷移、增生以及病理性重塑，來減少狹窄的發(fā)生。其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。作者單位：李光（510100廣州市廣東省心血管病研究所心內(nèi)科）陳紀(jì)言（510100廣州市廣東省心血管病研究所心內(nèi)科）周穎玲（510100廣州市廣東省心血管病研究所心內(nèi)科）耿慶山（510100廣州市廣東省心血管病研究所心內(nèi)科）譚寧（510100廣州市廣東省心血管病研究所心內(nèi)

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