土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物分子生態(tài)學(xué)研究_圖文

1、 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文(雷娟利.2006加導(dǎo)致遷移率的變化減少,難以將正常DNA分子和突變DNA分子分開。此外,高熔點(diǎn)區(qū)的解鏈時(shí)間較長,也使得應(yīng)用DGGE受到限制。解決的辦法一般是在PCR 引物的5末端加上一段4050bp的GC夾。DGGE法研究微生物多樣性的基本步驟為(Muyzer,1999;Niemi et a1.,2001; Dunbar et a】.,1999:抽提DNAPCR擴(kuò)增SSUrDNA(16S rDNA或18S rDNA一PCR產(chǎn)物的變性梯度分離及帶譜分析一回收DGGE電泳片段一DNA序列測定一將測得的SSUrDNA序列與rDNA序列數(shù)據(jù)庫中已知微生物的rDNA序列相比較一獲

2、得土壤中可能含有的微生物(包括不可培養(yǎng)微生物的信息。 圖1土壤微生物群落多樣性的分子生物學(xué)分析方法示意圖(Rajard et a1.,2000 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文(雷娟利,2006以從土壤中直接提取的總DNA為模板,以fDl,rPl分別為正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均得到了一條特異的擴(kuò)增片段,大小約為1.4kb,為細(xì)菌16s rDNA的近全長片段(圖2-2。對于菜田土壤,共得到了75個(gè)含有細(xì)菌16S rDNA片段的陽性克隆,經(jīng)PCR-RFLP分析后顯示,共有33種16S rDNA基因型(表2-3,圖23。其中,基因型1具有最高的基因型頻率(10.7%,其次為基因型24,23,4,3,13,21

3、和6,這7個(gè)基因型分別具有4-8%的基因型頻率,其余16個(gè)基因型的頻率不超過2%(圖2.4。對于水稻田土壤,共得到55個(gè)含有細(xì)菌16S rDNA片段的陽性克隆,經(jīng)PCR-RFLP分析后顯示,共有17種16S rDNA基因型(表2-4,圖25。其中,基因型3具有絕對優(yōu)勢的型頻率(36.4%,超過三分之一的克隆屬于這種類型。其余的16種基因型,其頻率相對較低,在l%至7%之間(圖26。圖2-1從土壤中提取的總DNA Fig.2-1Total DNA isolated from soil M分子量標(biāo)記molecular marker I菜田土壤Vegetable soil2水稻田土壤Rice soi

4、l 圖2-2PCR擴(kuò)增的細(xì)菌16S rDNA片段Fig.22PCR products of16S rDNA fragments M分子量標(biāo)記molecular markerl菜田土壤Vegetable soil2水稻田土壤Rice soil浙江大學(xué)博士學(xué)位論文(雷娟利.2006表23.菜田與水稻田土壤細(xì)菌多樣性的比較TabLe2-3Comparison ofthe bacterial diversity betweenvegetable and rice soil 圖2-3.菜田土壤細(xì)菌16S rDNARFLP圖譜Fig.23.Restriction fragment patterns ofb

5、acterial in vegetable soil.M,分子標(biāo)記,Molecular marker lane;1-33代表不同的細(xì)菌16S rDNA基因型編號.Lane1-33 ale corresponding to numbers ofbacterial16S rDNA genotype.Genotypes圖2-4菜田土壤細(xì)菌16S rDNA基因型頻率Fig.24.Bacterial 16S rDNA genotypes and their frequencies in vegetable soil圖2-5.水稻田土壤細(xì)菌16S rDNA RFLP圖譜M,分子標(biāo)記,Molecular m

6、arker lane;01-17代表不同的細(xì)菌16S rDNA基因型編號,Lane1-17are corresponding to numbers ofbacterial 16S rDNA genotype.Genotypes圖2-6.水稻田細(xì)菌16S rDNA基因型頻率Fig.26.Bacterial 16S rDNA genotypes and their frequencies in rice soil.272O8642一。小v 055O5O5妒斡乳串封擎; 占 。f浙江大學(xué)博士學(xué)位論文(雷娟利,2006香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon diversity indexN/辛普森指數(shù)(Sim

7、psonS index:是廣泛應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究的參數(shù),在本研究中,也采用了這兩個(gè)參數(shù)來分析土壤樣品的真菌群落多樣性。多樣性指數(shù)的計(jì)算通過biodap(BIODIVERSITY DATA ANALYSIS PACKAGE軟件進(jìn)行分析。3.結(jié)果與分析將從菜田和水稻田土壤中提取的微生物總基因組DNA溶液,經(jīng)O.8%的瓊脂糖凝膠電泳,均出現(xiàn)大于lOkb的一條純的DNA條帶(圖2-1,表明已獲得了比較純的土壤的微生物總DNA。同其它的土壤DNA提取的方法比較,用MoBio Kit所提的DNA,純度較高,不含植酸,無需經(jīng)過其它純化步驟,即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以從土壤中直接提取的總DNA為模板,以EF4E

8、F3r分別為正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均得到了一條特異的擴(kuò)增片段,大小約為1.5kb,為真菌18S rDNA的近全長片段(圖3.1。 圖3-1PCR擴(kuò)增的真菌18S rDNA片段Fig.3一l PCR products of189rDNA fragmentsM分子量標(biāo)記molecular marker1菜田土壤Vegetable soil2水稻田土壤Rice soil 浙江大學(xué)博士學(xué)位論文(雷娟利,2006 3.結(jié)果分析從各土壤樣品中直接提取的總DNA,經(jīng)O.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,均出現(xiàn)了大于10kb的條帶如圖4-2,表明已獲得了土壤中總的微生物基因組DNA。 Fig.4-2.Tota

9、l DNA directly isolated from soil samples無論是以土壤總DNA直接為模板,還是以fDl/rPl引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,均可用引物341fGC/534r擴(kuò)增到預(yù)期大小的片段(圖4-3。將直接PCR產(chǎn)物和巢式PCR 產(chǎn)物所得的16S rDNA片段,分別通過DGGE分析,均可得到若干分離的條帶,如圖所示。但是直接PCR產(chǎn)物的DGGE條帶比較模糊,相比之下,巢式PCR-DGGE 條帶就比較清晰。即巢式PCR的DGGE可分離的條帶要比直接PCRDGGE可分離的條帶要多,如圖44和表43。 圖4-3.土壤總DNA的直接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4-3.Direct PCR products from soil total DNA如圖4-4,4-