兔雪旺細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用

1、    兔雪旺細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用        【摘要】目的觀察在體外兔雪旺細(xì)胞（Schwann cell，SC）對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用。方法乳兔視網(wǎng)膜細(xì)胞分別接種在培養(yǎng)2周的單層SC和多聚賴(lài)氨酸（poly-L-lysine）表面培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀態(tài)并在培養(yǎng)的24、48小時(shí)測(cè)量其突起的長(zhǎng)度。結(jié)果視網(wǎng)膜細(xì)胞在SC表面生長(zhǎng)活躍，體外培養(yǎng)24小時(shí)，神經(jīng)元突起的平均長(zhǎng)度達(dá)到（85±17）m，48小時(shí)為（283±27）m，

2、與無(wú)SC共同培養(yǎng)的對(duì)照組相比有顯著差異（P001）。結(jié)論體外SC對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)具有明顯的支持、促進(jìn)作用。【關(guān)鍵詞】細(xì)胞，培養(yǎng)的許旺氏細(xì)胞神經(jīng)元視網(wǎng)膜中國(guó)書(shū)資料分類(lèi)法分類(lèi)號(hào)R339141R32925Effects of rabbit Schwann cells on promoting neurite growth of retinal neurons CaiLi，HuiYannian，MenJinhongDepartment of Ophthalmology，Xijing Hosptial，The 4th Military MedicalUniversity，Xian710032，C

3、hina【Abstract】ObjectiveTo study the effects of Schwann cells（SC）on promoting and supporting axon growth of rabbit retinal neurons in vitroMethodsThe sciatic nerves of neonatal rabbits were dissected and cultured for 2 weeks to obtain SC monolayersThe retinal cells that had been freshly dispersed wer

4、e seeded respectively onto the SC monolayers or poly-L-lysine-covered dishes，and the morphology of cultured retinal neurons was observed and the neurite length of neurons was measured at the 24th hour and 48th hour respectively under the phase contrast microscopicResultsRetinal neurons of neonatal r

5、abbits attached to the two substrate and extended axons at the 24th hourNeurite length on SC reached 85±17m at the 24th hour and 283±27m at the 48th hour respectively and was significantly longer than on acellular substrate（P001）ConclusionSCs are effective in promoting and supporting neuri

6、te growth of retinal neurons in vitro【Key words】Cells，culturedSchwann cellsNeuronsRetina視神經(jīng)損傷和變性常引起不可逆的視力喪失，視神經(jīng)再生已成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。視神經(jīng)再生困難據(jù)認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）膠質(zhì)微環(huán)境抑制神經(jīng)再生有關(guān)，少突膠質(zhì)細(xì)胞及其形成的髓鞘含有抑制神經(jīng)再生的大分子物質(zhì)1，而SC是體內(nèi)唯一的在任何時(shí)期都能支持和引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，文獻(xiàn)報(bào)道SC在體外對(duì)中樞神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用2，但關(guān)于兔SC對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，

7、未見(jiàn)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察兔SC是否對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。1材料與方法11乳兔SC培養(yǎng)無(wú)菌條件下取生后1天的新西蘭乳兔坐骨神經(jīng)，置于盛有4D-Hanks平衡鹽液的培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下剝除神經(jīng)外膜和束膜，剪碎組織，加入025胰蛋白酶（Sigma）和003膠原酶（Sigma），37下消化30分鐘，用直頭吸管將消化后的組織吸入裝有100gml胰酶抑制劑（Sigma）的試管中，室溫下放置10分鐘。改良Eagle培養(yǎng)液（Dulbecco?smodified Eagle?s medium，DMEM，GIBCO）漂洗2次后離心，棄去上清液，加入含20胎牛血清（fetal calf seru

8、m，F(xiàn)CS，Sigma）的DMEM23ml，輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后種于預(yù)先涂有poly-L-lysine的培養(yǎng)瓶中，置37、5CO2孵箱培養(yǎng)。經(jīng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后，加入105molL阿糖胞苷（Sigma）抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)3。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，棄去含抑制劑的培養(yǎng)液，加入含20FCS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。1周后采用低濃度酶快速消化法再次純化SC4，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入0125胰酶消化2分鐘后，見(jiàn)位于底層的成纖維細(xì)胞仍貼壁，而SC突起回縮，細(xì)胞變圓，立即終止消化，將脫落的SC離心收集，種于另一新的涂有poly-L-lysin的培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，使細(xì)胞長(zhǎng)成單層。4多聚甲醛固定，抗S-100常

9、規(guī)免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞成分。12乳兔視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下摘取生后1天的新西蘭乳兔眼，置于4的D-Hanks液中，解剖顯微鏡下棄去眼前節(jié)和玻璃體，輕輕揭取視網(wǎng)膜感覺(jué)層，剪碎后加入025胰蛋白酶37消化15分鐘，用胰酶抑制劑終止消化10分鐘，加入含5FCS的DMEM1ml輕柔吹打，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以細(xì)胞密度106ml種于單層的SC表面，對(duì)照實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞種于預(yù)先涂有poly-L-lysine但無(wú)SC的培養(yǎng)瓶中。置37、5CO2孵箱培養(yǎng)，隔日換液。視網(wǎng)膜細(xì)胞種植后24、48小時(shí)在倒置顯微鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量神經(jīng)元最長(zhǎng)突起生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，每次測(cè)量10個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)觀察10天后，4多聚甲醛固定，抗神經(jīng)

10、元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE，Sigma）常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。2結(jié)果21SC的原代及傳代培養(yǎng)SC種植后24小時(shí)貼壁，伸展成典型梭形，雙極，細(xì)胞體積小，細(xì)胞核明顯并有發(fā)亮的邊緣。也可見(jiàn)少量多角形、散在分布的扁平成纖維細(xì)胞位于培養(yǎng)細(xì)胞底層。經(jīng)阿糖胞苷抑制并低濃度酶快速消化純化后，傳代培養(yǎng)瓶中90左右的細(xì)胞為梭形SC（1）。培養(yǎng)1周的傳代SC形態(tài)同原代，細(xì)胞密度高，呈柵欄樣排列。免疫組織化學(xué)抗S-100蛋白染色陽(yáng)性，證實(shí)為SC。22視網(wǎng)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞種植在poly-L-lysine表面后24小時(shí)，懸浮細(xì)胞較多，部分細(xì)胞貼壁，成團(tuán)狀或散在分布。

11、有的貼壁細(xì)胞可見(jiàn)纖細(xì)突起伸出，突起平均長(zhǎng)度為（50±13）m，伸出突起的細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞體積小而發(fā)亮（2）。而接種在SC表面后24小時(shí)，懸浮細(xì)胞較少，多個(gè)細(xì)胞伸出細(xì)長(zhǎng)突起，突起平均長(zhǎng)度為（85±17）m，兩組之間差異顯著（t517，P001）。培養(yǎng)48小時(shí)后兩組突起均有明顯伸長(zhǎng)，在小圓細(xì)胞周?chē)史派錉罘植迹趐oly-L-lysine表面突起的平均長(zhǎng)度為（103±29）m，而在SC表面突起的平均長(zhǎng)度為（283±25）m，兩組之間差異顯著（t1486，P001）。培養(yǎng)3天時(shí)，對(duì)照組突起纖細(xì)，分布散亂，與周?chē)?xì)胞發(fā)生接觸；而在SC表面突起直徑較粗，末端常有一

12、折光性強(qiáng)的膨大，多個(gè)突起延伸后與周?chē)鶶C發(fā)生聯(lián)系，但未見(jiàn)SC沿突起平行排列。培養(yǎng)5天時(shí)，在SC表面大量伸出的突起相互交聯(lián)，逐漸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。體外生長(zhǎng)10天時(shí)，在poly-L-lysine表面培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞可分為3類(lèi)（3）：聚集呈團(tuán)，細(xì)胞體折光性強(qiáng)，有細(xì)長(zhǎng)突起伸出的小圓細(xì)胞，抗NSE免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性，確認(rèn)為神經(jīng)元細(xì)胞。其中，又可分為單極、雙極、多極神經(jīng)元細(xì)胞；位于小圓細(xì)胞下層，折光性差，排列緊密，界限不清，分裂增殖旺盛的扁平細(xì)胞；散在分布，細(xì)胞體呈梭型，無(wú)明顯分裂增殖的雙極細(xì)胞，神經(jīng)元突起與之接觸時(shí)未見(jiàn)回避現(xiàn)象。視網(wǎng)膜細(xì)胞在SC表面培養(yǎng)10天時(shí)，基本細(xì)胞形態(tài)同上，但神經(jīng)元突起伸出更為廣泛，

13、與周?chē)腟C、成纖維細(xì)胞、其它神經(jīng)元細(xì)胞建立了非常廣泛的聯(lián)系，形成極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（4）。 1SC傳代后培養(yǎng)1周的相差顯微鏡像。90的細(xì)胞為梭形SC，呈柵欄樣排列×2002視網(wǎng)膜細(xì)胞在poly-L-lysine表面培養(yǎng)24小時(shí)的相差顯微鏡像。細(xì)胞突起伸出（箭），細(xì)胞體發(fā)亮，呈小圓形×2003視網(wǎng)膜細(xì)胞在poly-L-lysine表面培養(yǎng)10天時(shí)的相差顯微鏡像。細(xì)胞分為3類(lèi)：聚集成團(tuán)，細(xì)胞體發(fā)亮，有細(xì)長(zhǎng)突起伸出的小圓細(xì)胞（S）；下層折光性差的扁平細(xì)胞（f）；散在分布的梭形雙極細(xì)胞（箭）×4004視網(wǎng)膜細(xì)胞在SC表面培養(yǎng)10天時(shí)的相差顯微鏡像。神經(jīng)元突起廣泛伸出，

14、與周?chē)?xì)胞聯(lián)系形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)×2003討論關(guān)于SC和視網(wǎng)膜組織的體外培養(yǎng)，文獻(xiàn)中實(shí)驗(yàn)材料多來(lái)源于小鼠、大鼠、貓或人25，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用乳兔。SC培養(yǎng)方法有分散法及植塊法兩種，大多由坐骨神經(jīng)分離純化獲得。坐骨神經(jīng)主要包含SC和成纖維細(xì)胞兩種細(xì)胞成分，鑒定SC的方法包括：形態(tài)學(xué)鑒定，培養(yǎng)的SC在相差顯微鏡下呈典型雙極梭形細(xì)胞，與扁平的成纖維細(xì)胞有很明顯的差別；免疫學(xué)鑒定，SC抗原Ran-1、S-100染色陽(yáng)性，而成纖維細(xì)胞Thy11染色呈陽(yáng)性4。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的乳兔SC形態(tài)與以往報(bào)道的鼠或人SC形態(tài)相同，但細(xì)胞種植后貼壁困難，對(duì)底物要求高，除poly-L-lysine外，在塑料培養(yǎng)皿、無(wú)培

15、養(yǎng)基的玻璃皿、涂有鼠尾膠的玻璃皿中都不生長(zhǎng)，較報(bào)道的乳鼠SC培養(yǎng)困難4。體外純化SC的方法很多，有報(bào)道用免疫吸附的方法可以得到純度97以上的SC6，但考慮補(bǔ)體溶解過(guò)程對(duì)SC活性會(huì)造成損害，我們采用阿糖胞苷抑制并低濃度酶快速消化法純化SC，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞損傷小，傳代后抗S-100染色證實(shí)90細(xì)胞為SC。視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)常采用組織塊法，用無(wú)血清培養(yǎng)液在高濃度氧環(huán)境下孵育2，5。由于此法難以觀察神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞間的相互作用，且培養(yǎng)液價(jià)格昂貴，我們采用Melvin報(bào)道的視網(wǎng)膜細(xì)胞分散培養(yǎng)法7，操作簡(jiǎn)便，有利于觀察視網(wǎng)膜不同類(lèi)型細(xì)胞的形態(tài)及相互作用；用DMEM-5FCS作為培養(yǎng)液，不僅利于視網(wǎng)膜細(xì)胞貼壁

16、，而且在體外培養(yǎng)10天時(shí)視網(wǎng)膜細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。本實(shí)驗(yàn)中，視網(wǎng)膜細(xì)胞種植后24小時(shí)在單層SC表面和poly-L-lysine表面都可以貼附生長(zhǎng)并伸出突起。Hopkins曾經(jīng)認(rèn)為視網(wǎng)膜組織塊不能在poly-L-lysine、層粘連蛋白（laminin）等底物表面貼附生長(zhǎng)5，可能與實(shí)驗(yàn)材料、培養(yǎng)基不同有關(guān)。乳兔視網(wǎng)膜細(xì)胞在培養(yǎng)后從形態(tài)學(xué)上可分為3類(lèi)：即上層發(fā)亮的小圓細(xì)胞、少量梭性細(xì)胞、下層界限不清折光性差的扁平細(xì)胞。上層小圓細(xì)胞有細(xì)長(zhǎng)突起伸出，抗NSE染色陽(yáng)性，判斷為神經(jīng)元細(xì)胞。Melvin曾描述了類(lèi)似形態(tài)的細(xì)胞7，他根據(jù)這類(lèi)細(xì)胞不可分裂，能結(jié)合霍亂毒素并攝取多種神經(jīng)遞質(zhì)，指出這類(lèi)細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)

17、元細(xì)胞，同時(shí)還指出下層分裂迅速的扁平細(xì)胞抗GFAP染色陽(yáng)性，為Müller細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還觀察到了另一類(lèi)形態(tài)類(lèi)似SC的雙極細(xì)胞，沒(méi)有明顯分裂增殖現(xiàn)象，可與神經(jīng)元突起發(fā)生接觸，以往文獻(xiàn)未見(jiàn)有描述，其性質(zhì)有待于進(jìn)一步證實(shí)。視網(wǎng)膜細(xì)胞種植在SC表面24小時(shí)，懸浮細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，說(shuō)明SC對(duì)神經(jīng)元的貼壁具有粘附性，是良好的培養(yǎng)底物。培養(yǎng)24、48小時(shí)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)迅速，突起長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，說(shuō)明SC對(duì)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)具有支持、促進(jìn)作用，與以往各家報(bào)道相符2，5。此外，我們還觀察到在體外培養(yǎng)10天時(shí)，對(duì)照組神經(jīng)元突起纖細(xì)呈放射狀散亂分布，神經(jīng)元之間的聯(lián)系較少。而在SC

18、表面神經(jīng)元突起較粗，神經(jīng)元之間聯(lián)系廣泛，形成極為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，提示SC與視網(wǎng)膜細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)還能夠促進(jìn)神經(jīng)元之間聯(lián)系的建立。SC的上述作用，據(jù)認(rèn)為與SC能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)節(jié)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)；此外，它還能合成釋放、型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，表達(dá)細(xì)胞粘附因子、神經(jīng)類(lèi)固醇因子黃體酮等8，9，實(shí)驗(yàn)證明它們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)都具有重要作用。進(jìn)一步探討SC的作用機(jī)制，對(duì)于未來(lái)臨床將SC移植入體內(nèi)促進(jìn)中樞神經(jīng)再生具有重要意義。作者單位：710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科（蔡莉、惠延年），神經(jīng)生物教研室（孟晉宏

19、）4參考文獻(xiàn)1Bandtlow CE，Zachleder T，Schwab MEOligodendrocytes arrestneurite growth by contact inhibitionJ Neurosci，1991，10：3837-38482Hopkins JM，Bunge RPRegeneration of axons from adult rat retinal ganglion cells on cultured Schwann cells is not dependent on basal laminaGlia，1991，4：46-553嚴(yán)恒林，沈馨亞，劉才棟，等脊髓節(jié)來(lái)源的人胎兒雪旺氏細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究解剖學(xué)雜志，1995，18：203-2054張自杰，朱家愷乳鼠雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)純凈和形態(tài)學(xué)研究中華顯微外科雜志，1991，14：42-455Hopkins JM，Bunge RPRegeneration of axons from adult human retina in vitroExp Neurol，19