生長激素和胰島素樣生長因子與小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的研究

1、    生長激素和胰島素樣生長因子與小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的研究楊毅郭履馬力劉湘云 【摘要】目的研究生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGFs)對小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用及其機制。方法采用放射受體競爭結(jié)合、核酸分子雜交、免疫組化等方法，從蛋白質(zhì)和(或)基因表達水平系統(tǒng)觀察了GH及其受體(GHR)、IGF多肽(IGF-I、-II)、受體(IGF-IR、-IIR)和結(jié)合蛋白(IGFBP1-6)在小兒外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、胸腺和淋巴結(jié)的表達、分布與調(diào)節(jié)。結(jié)果GHR在PBL的表達呈年齡相關(guān)的變化；胸腺、淋巴結(jié)和PBL都有GH合成細(xì)胞，且GH缺乏患兒與正常人無異

2、；IGFs多肽、受體和結(jié)合蛋白基因在兒童胸腺和淋巴結(jié)均有不同水平的表達，提示它們在免疫器官局部以自分泌或旁分泌的形式產(chǎn)生和發(fā)揮作用。結(jié)論GH-IGF對于影響和調(diào)節(jié)小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。 【關(guān)鍵詞】促生長素生長調(diào)節(jié)素類免疫系統(tǒng)兒童 The effects of growth hormone and insulin-like growth factor on development of the immune system in childhood Yang Yi, Guo Luzhou, Ma Li, et al. Children"s Hospital, Shanghai M

3、edical University, Shanghai 200032 【Abstract】ObjectiveTo study the effect of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor (IGF) on development of the immune system in childhood. MethodsRRA, dot blot, in situ hybridization, and immunohistochemistry were used to determine the expression and dist

4、ribution of GH, growth hormone receptor (GHR), IGFs, IGF receptors (IGFRs) and IGFs binding protein genes and/or proteins in children"s thymus, lymphonodus and peripheral blood lymphocytes (PBL). ResultsThe age-related GHR expression was found in PBL. The GH synthesizing cells were found in thy

5、mus, lymphonodus and PBL. There was no significant difference between the children with GH deficiency and the controls in the levels of GH synthesizing cells. All compounds of IGF genes were expressed in immune organs and cells in varying levels, and were related to the immune development and functi

6、ons.ConclusionGH-IGF may play an important role in the regulation of development and functions of the immune system in childhood. 【Key words】SomatotropinSomatomedinsImmune systemChild 生長激素(GH)是調(diào)節(jié)小兒生長發(fā)育最重要的內(nèi)分泌激素之一，胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth factors，IGFs)與GH的作用密切相關(guān)，不少研究結(jié)果提示，GH和IGFs對免疫系統(tǒng)發(fā)育及功能維持可能具有重要

7、意義1，2。為了深入研究GH-IGF對小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控影響及其機制，我們采用放射受體結(jié)合，核酸分子雜交，免疫組化等方法，從蛋白質(zhì)和(或)基因表達水平系統(tǒng)觀察了GH及其受體(GHR)，IGFs多肽(IGF-I、-II)及其受體(IGF-IR、-IIR)，IGF結(jié)合蛋白(IGF BP1-6)在小兒外周血淋巴細(xì)胞，胸腺和淋巴結(jié)的表達、分布與調(diào)節(jié)。 資料及方法 一、不同年齡階段外周血淋巴細(xì)胞GHR的檢測 1. 標(biāo)本來源：不同年齡階段靜脈血標(biāo)本分別來自上海市血液中心健康獻血者（成人組）、本院體檢兒童、本校婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)房（新生兒臍血組）。 2. 放射受體競爭結(jié)合分析：靜脈血常規(guī)分離單個核細(xì)胞后，用玻

8、器吸附法去除巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞采用125I-hGH（衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品）和非標(biāo)記的rhGH（中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供），參照Kiess等3的方法檢測GHR總結(jié)合率和特異性結(jié)合率。 3. GHR mRNA水平檢測:應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)構(gòu)建hGHR DNA探針，32P隨機引物法標(biāo)記，淋巴細(xì)胞抽提RNA后進行斑點雜交，放射自顯影底片作灰度掃描和定量分析。 二、淋巴細(xì)胞合成GH的觀察 1.標(biāo)本來源與制備:正常胸腺和淋巴結(jié)取自本院外科手術(shù)切除標(biāo)本，常規(guī)制備石蠟片;垂體性侏儒癥系本院門診隨訪患兒的標(biāo)本作全血培養(yǎng)72小時后涂片固定。 2.免疫組化染色:采用兔抗人GH抗體(購自DAKO

9、公司)作ABC法免疫組化染色。 三、原位雜交觀測IGFs各基因在胸腺和淋巴結(jié)的表達與分布 1.組織標(biāo)本來源與制備:胸腺和淋巴結(jié)標(biāo)本來源同上，4多聚甲醛固定后，制備冰凍切片。 2.原位雜交:hIGF-I、-II、-IR、-IIR、BP 1-6十個cDNA探針均由德國慕尼黑大學(xué)兒童醫(yī)院W.Kiess博士惠贈，采用德國寶靈曼公司的DIG RNA Labeling Kit轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反意義RNA探針。組織切片在42雜交過夜，免疫顯色用德國寶靈曼公司的DIG nucleic acid detection kit。 結(jié)果 一、各年齡組淋巴細(xì)胞GHR總結(jié)合百分率和特異結(jié)合百分率的測定結(jié)果(圖1) 圖1各年齡階段

10、淋巴細(xì)胞GHR總結(jié)合率和特異結(jié)合率 用t檢驗對各組間均值差別進行顯著性檢驗，成人組GHR總結(jié)合率和特異結(jié)合率均高于各兒童年齡組和臍血組，差別有顯著意義(t=4.429、2.636，P< 0.01、P< 0.05)；各兒童組和臍血組之間差異無顯著意義。 二、不同年齡階段淋巴細(xì)胞GHR mRNA水平(圖2) 初生時最低，而后迅速增加，但在整個兒童期直至青春前期都沒有明顯變化(P>0.05)，在成年期達到高峰，各兒童組與成年組相比，差異均有非常顯著意義(t=6.649、4.279，P< 0.001)。 圖2不同年齡階段淋巴細(xì)胞hGHR mRNA水平檢測結(jié)果 三、免疫組化染色顯

11、示胸腺、淋巴結(jié)和外周血涂片均可見GH陽性細(xì)胞(棕黃染色)(圖3) 在胸腺中GH陽性細(xì)胞分布于胸腺髓質(zhì)，而皮質(zhì)缺如;在淋巴結(jié)GH陽性細(xì)胞集中于副皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)。垂體性侏儒癥患兒淋巴細(xì)胞無論是自發(fā)的，或經(jīng)PHA、PWM誘導(dǎo)后的GH陽性細(xì)胞百分率，與同齡正常兒或成人比較，差異均無顯著意義。 四、原位雜交結(jié)果 發(fā)現(xiàn)10個IGF基因在胸腺、淋巴結(jié)都有不同程度的表達。在胸腺IGF-I探針陽性雜交細(xì)胞多分布于小葉皮質(zhì)區(qū)和間隔區(qū)；IGF-IR和IGF-IIR探針陽性雜交細(xì)胞也多見于皮質(zhì)區(qū)；6種結(jié)合蛋白基因均有較豐富的表達，其中IGF BP 1、3、6 mRNA主要分布于小葉間隔和外皮質(zhì)區(qū)(紫色染色細(xì)胞)(圖4)

12、，IGF BP 2、4、5mRNA分布較均勻。在淋巴結(jié)IGFs基因主要在間質(zhì)網(wǎng)狀細(xì)胞表達(圖5)，IGF-I、IGF BP2和IGFBP3mRNA陽性表達細(xì)胞在淋巴結(jié)較均勻分布；IGF-IIR主要分布于成熟B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(圖6)；IGFBP4、5 mRNA陽性表達多見于副皮質(zhì)區(qū)。 討論 70年代就有學(xué)者證實人的胸腺和淋巴結(jié)上存在GHR4，80年代后期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞能自身合成和分泌GH5。這些研究結(jié)果提示，除了經(jīng)典的GH產(chǎn)生途徑外，免疫器官和細(xì)胞也能通過自分泌或旁分泌GH在免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。然而GH如何影響免疫系統(tǒng)功能還有待深入研究。不少實驗結(jié)果顯示，人外周血淋巴細(xì)胞和某些淋巴母細(xì)胞株

13、表達IGF受體6和產(chǎn)生IGF結(jié)合蛋白7，提示GH對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能也通過IGFs介導(dǎo)。 我們的研究結(jié)果表明，小兒從初生到成年期其淋巴細(xì)胞GHR，無論在受體結(jié)合水平還是在mRNA轉(zhuǎn)錄水平方面，都表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的變化。這一變化與小兒免疫系統(tǒng)功能發(fā)育成熟的年齡過程有平行趨勢，說明淋巴細(xì)胞在其生長分化和功能成熟過程中受到GH的影響與調(diào)節(jié)。 我們的實驗證實，人胸腺、淋巴結(jié)和PBL都有GH染色陽性細(xì)胞，則進一步說明淋巴細(xì)胞各個發(fā)育階段，包括非抗原依賴和抗原依賴發(fā)育階段的淋巴細(xì)胞都有GH合成，且在活化過程中一些原來不合成GH的細(xì)胞有可能轉(zhuǎn)為GH合成細(xì)胞，使局部GH產(chǎn)生增多。GH缺乏的垂體性侏儒患兒無明顯

14、的免疫缺陷，檢測其淋巴細(xì)胞合成GH能力仍屬正常，這可能是其免疫功能得以維持正常的原因之一。 IGF-I作為GH作用的介質(zhì)呈GH依賴性調(diào)節(jié)。我們采用原位雜交的方法對兒童胸腺和淋巴結(jié)的觀察，結(jié)果都顯示了IGF-I基因較豐富的表達，在胸腺主要分布于未成熟細(xì)胞集中的皮質(zhì)區(qū)，而在淋巴結(jié)主要是間質(zhì)的網(wǎng)狀細(xì)胞。說明IGF-I在胸腺淋巴細(xì)胞的自分泌和在淋巴結(jié)的旁分泌，提示通過局部產(chǎn)生IGF-I影響淋巴細(xì)胞成熟分化和功能維持，可能是GH對胸腺和淋巴結(jié)的作用途徑之一。 IGF BPs作為IGF-I的儲存和運輸載體，常與IGF-I同步產(chǎn)生，對游離IGF-I濃度起著重要調(diào)節(jié)作用。我們還發(fā)現(xiàn)，IGF BP 1-6基因在

15、胸腺和淋巴結(jié)都有較高水平的轉(zhuǎn)錄，且其分布與IGF-I mRNA是一致的，進一步提示IGF-I在上述免疫器官的自分泌和旁分泌，IGF BPs作為活躍的調(diào)節(jié)因子，還可通過影響IGF-I與IGFRs的結(jié)合參與IGFs對免疫系統(tǒng)的作用。 我們的研究發(fā)現(xiàn)IGF-IR和IGF-IIR基因在胸腺和淋巴結(jié)都有表達，IGF-IR mRNA在胸腺皮質(zhì)較豐富，可能主要介導(dǎo)IGF-I的促生長分化作用。淋巴結(jié)是產(chǎn)生特異性體液免疫的場所之一，IGF-IIR作為一種多功能受體參與細(xì)胞生理代謝，其在成熟B淋巴細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞較豐富的表達，可能與免疫球蛋白產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞加工處理抗原的過程有關(guān)。 總之，我們的研究證實，GH-I

16、GF的各組分在免疫系統(tǒng)器官和細(xì)胞都有程度不同的表達，并與免疫發(fā)育和功能狀態(tài)密切相關(guān)，充分顯示了GH-IGF影響和調(diào)節(jié)小兒免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟的重要意義。提示臨床應(yīng)用rhGH和rhIGF-I治療生長障礙、營養(yǎng)不良等，對患兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟可能也有促進作用，然而對于非GH缺乏患兒，大劑量長期給藥是否干擾免疫功能，值得進一步研究。 圖3 位于髓質(zhì)的胸腺細(xì)胞,胞漿GH染色陽性.ABC法*100(DAB) 圖4 原位雜交IGFBP3MRNA陽性表達主要分布于胸腺小葉間隔細(xì)胞NBT*100 圖5 原位雜交IGFBP2MRNA陽性表達較均勻分布于淋巴結(jié)網(wǎng)狀細(xì)胞NBT*100 圖6 原位雜交IGF-IIRMRN

17、A陽性表達多分布于淋結(jié)生發(fā)中心"帽狀區(qū)"和副皮質(zhì)區(qū)NBT*100 作者單位：200032 上海醫(yī)科大學(xué)兒科醫(yī)院 參考文獻 1Douglas A, Weigent J, Edwin B. Growth hormone and the immune system. Progress in NeuroEndocrinImmunology, 1990, 3:231-241. 2Marie C, Gelato. Growth hormone-insulinlike growth factor I and immune function. TEM, 1993, 4: 106-110.

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