浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲不同植物SOD提取及活力測(cè)定ppt課件

1、不同植物不同植物SOD提取及活力測(cè)定提取及活力測(cè)定1、SOD簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SOD是一種廣泛存是一種廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物中的金屬蛋白酶，在于動(dòng)、植物和微生物中的金屬蛋白酶，是一種重要的抗氧化劑，可清除自由基，是一種重要的抗氧化劑，可清除自由基，其清除自由基的反應(yīng)如下：其清除自由基的反應(yīng)如下： 生物體在長(zhǎng)期的生命活動(dòng)中，常常會(huì)因生物體在長(zhǎng)期的生命活動(dòng)中，常常會(huì)因?yàn)榄h(huán)境因素或生理?xiàng)l件的變化而出現(xiàn)氧為環(huán)境因素或生理?xiàng)l件的變化而出現(xiàn)氧自由基增加、抗氧化能力降低的情況，自由基增加、抗氧化能力降低的情況，并由此引發(fā)一系列疾病。如脂質(zhì)的過(guò)氧并由此引發(fā)一系列疾病。如脂質(zhì)的過(guò)氧化與膜疾

2、病、腫瘤、衰老、心血管疾病、化與膜疾病、腫瘤、衰老、心血管疾病、創(chuàng)傷、輻射損傷、高度中毒等。創(chuàng)傷、輻射損傷、高度中毒等。O2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2SOD不同植物不同植物SOD提取及活力測(cè)定提取及活力測(cè)定 SOD由于可以清除氧自由基，因此可以防止這些疾由于可以清除氧自由基，因此可以防止這些疾病的產(chǎn)生。而且，病的產(chǎn)生。而且，SOD還可作為一種添加劑，添加還可作為一種添加劑，添加到化妝品和食品中，在預(yù)防和治療由于自由基增多到化妝品和食品中，在預(yù)防和治療由于自由基增多而引起的一系列疾病和延緩衰老方面起到一定作用。而引起的一系列疾病和延緩衰老方面起到一定作用。 2、活性測(cè)定原理、活性

3、測(cè)定原理 SOD活性測(cè)定的方法很多，常見(jiàn)的有化學(xué)法，免疫活性測(cè)定的方法很多，常見(jiàn)的有化學(xué)法，免疫法和等電聚焦三種，其中以化學(xué)法應(yīng)用最普遍。法和等電聚焦三種，其中以化學(xué)法應(yīng)用最普遍。不同植物不同植物SOD提取及活力測(cè)定提取及活力測(cè)定 本試驗(yàn)即采用化學(xué)法來(lái)測(cè)定本試驗(yàn)即采用化學(xué)法來(lái)測(cè)定SOD的活性，使用的試的活性，使用的試劑為氮藍(lán)四唑劑為氮藍(lán)四唑NBT），），NBT在光照下能與在光照下能與O2發(fā)發(fā)生光化還原反應(yīng)生成藍(lán)色甲潛生光化還原反應(yīng)生成藍(lán)色甲潛qian），該化合物），該化合物在在560nm處具特征光吸收，而處具特征光吸收，而SOD能抑制能抑制NBT的光的光化還原，有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)式如下：化還原，有

4、關(guān)的化學(xué)反應(yīng)式如下： 不同植物不同植物SOD提取及活力測(cè)定提取及活力測(cè)定 核黃素，核黃素，TEMEDO2 O2光照光照還原劑還原劑NBT + O2 甲甲qian）藍(lán)色，藍(lán)色，560nm處具特征光吸收，處具特征光吸收，OD值與值與 O2 含量成正比。含量成正比。光照光照SOD光照光照NBT + O2 抑制反應(yīng)抑制反應(yīng)抑制原因：抑制原因：SODO2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2 SOD對(duì)對(duì)NBT光化還原的抑制程度與光化還原的抑制程度與SOD活性成正比，活性成正比，故可通過(guò)比色法測(cè)出故可通過(guò)比色法測(cè)出SOD的抑制率，以抑制光化還原反的抑制率，以抑制光化還原反應(yīng)的應(yīng)的50%為一個(gè)活力單位，

5、即可計(jì)算出為一個(gè)活力單位，即可計(jì)算出SOD的活力。的活力。不同植物不同植物SOD提取及活力測(cè)定提取及活力測(cè)定3、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)步驟各步試驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)解說(shuō)祥見(jiàn)各步試驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)解說(shuō)祥見(jiàn)p118。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及處理、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及處理SOD活性計(jì)算公式：活性計(jì)算公式：OD對(duì)照對(duì)照-OD測(cè)試測(cè)試OD對(duì)照對(duì)照10050 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) WSOD活性活性u(píng)/g鮮重）鮮重）=（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色1、SOD同工酶簡(jiǎn)介同工酶簡(jiǎn)介在高等生物的組織和器官中普遍存在著在高等生物的組織和器官中普遍存在著SOD同工酶，按其結(jié)合的金屬離子的不同工酶，按其結(jié)合的金屬離子的不同可分為：同可分為：F

6、e-SOD，Mn-SOD，Cu、Zn-SOD三種，這三種酶均能催化氧自由三種，這三種酶均能催化氧自由基的清除反應(yīng)。基的清除反應(yīng)。Fe-SOD，Mn-SOD在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、分子量、光譜性質(zhì)及對(duì)不同空間結(jié)構(gòu)、分子量、光譜性質(zhì)及對(duì)不同抑制劑的敏感性等方面與抑制劑的敏感性等方面與Cu、Zn-SOD差差別較大。別較大。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色 Mn-SOD在真核生物中多為四聚體，在原核生物中在真核生物中多為四聚體，在原核生物中為二聚體。為二聚體。 Fe-SOD大多數(shù)為二聚體。大多數(shù)為二聚體。 這兩種這兩種SOD的許多性質(zhì)都很相似，如兩種酶的一級(jí)的許多性質(zhì)都

7、很相似，如兩種酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)均很相似，每個(gè)亞基的分子量一般結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)均很相似，每個(gè)亞基的分子量一般均為均為23000D，并含有，并含有0510個(gè)個(gè)Mn或或Fe原子。不原子。不同來(lái)源的同來(lái)源的Fe-SOD和和Mn-SOD其一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性均其一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性均很高。很高。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色 Cu、Zn-SOD則一般是由兩個(gè)相同的亞基組成的二則一般是由兩個(gè)相同的亞基組成的二聚體，每個(gè)亞基的分子量約為聚體，每個(gè)亞基的分子量約為16000D，含一個(gè)銅原，含一個(gè)銅原子及一個(gè)鋅原子，不同來(lái)源的子及一個(gè)鋅原子，不同來(lái)源的Cu、Zn-SOD其一級(jí)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性也很高。結(jié)

8、構(gòu)的同源性也很高。 2、SOD同工酶活性染色原理同工酶活性染色原理 由于三種由于三種SOD同工酶的分子量和電荷間存在差異，同工酶的分子量和電荷間存在差異，因此可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳法將三種因此可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳法將三種SOD同工同工酶分開(kāi)。酶分開(kāi)。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色 電泳完后，根據(jù)電泳完后，根據(jù)SOD活性測(cè)定原理，將活性測(cè)定原理，將NBT溶液加溶液加入凝膠，在光照下，凝膠中不含入凝膠，在光照下，凝膠中不含SOD的地方，由于的地方，由于NBT進(jìn)行光化還原生成藍(lán)色甲潛，因此凝膠呈藍(lán)色；進(jìn)行光化還原生成藍(lán)色甲潛，因此凝膠呈藍(lán)色； 而在而在SOD同工酶譜帶處，由于同工酶譜帶處，由于SOD抑制抑制NBT的光化的光化還原，無(wú)藍(lán)色甲潛的生成，因此凝膠透明，即藍(lán)色還原，無(wú)藍(lán)色甲潛的生成，因此凝膠透明，即藍(lán)色背景下的透明帶即為背景下的透明帶即為SOD同工酶譜帶。通過(guò)這種方同工酶譜帶。通過(guò)這種方法，可觀察到不同來(lái)源法，可觀察到不同來(lái)源SOD同工酶之間以及同一來(lái)同工酶之間以及同一來(lái)源不同發(fā)育階段之間源不同發(fā)育階段之間SOD同工酶的差異。同工酶的差異。（二（二SOD同工酶活性染色同工酶活性染色3、材料與試劑、材料與試劑 試驗(yàn)材料：新鮮植物葉片。試驗(yàn)材料：新鮮植物葉片。 試驗(yàn)試劑：詳見(jiàn)試驗(yàn)試劑：詳見(jiàn)P117。4、操作方法、操作方法