淺議植物組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物生產(chǎn)上的應(yīng)用

1、淺議植物組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物生產(chǎn)上的應(yīng)用羅春梅 張良彪（云南省楚雄農(nóng)業(yè)學(xué)校 云南 楚雄 675000）摘要 本文針對藥用植物在生產(chǎn)中存在的問題，闡述了植物組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物的快速繁殖、無病毒苗生產(chǎn)、選育新品種、種質(zhì)資源保存、次生代謝物的生產(chǎn)等幾個領(lǐng)域中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞 植物組織培養(yǎng)技術(shù)；藥用植物；生產(chǎn)；應(yīng)用中國是藥用植物資源最豐富的國家之一。據(jù)記載，我國可供藥用的植物有5000多種，其中較常用的有500多種，且需要量大，主要依靠人工栽培的有250多種。由于長期以來盲目采挖，嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境；人工栽培品種又面臨品種退化、農(nóng)藥和重金屬污染以及種子帶病、繁殖和栽培技術(shù)落后等原因，嚴(yán)重影響了藥材

2、品質(zhì)，有許多重要的藥用植物的天然生產(chǎn)量極少，故供應(yīng)已十分困難，如天麻、杜仲、貝母等。有100多種中藥已被國家列為瀕危、稀有植物，如海南大楓子、藥用野稻、見血封喉等1。由于植物組織培養(yǎng)具有：研究材料來源單一，遺傳背景一致；經(jīng)濟(jì)方便、效率高；條件可控誤差小；生長周期短、重復(fù)性強(qiáng)；可周年試驗(yàn)或生長等優(yōu)點(diǎn)。在藥用植物日漸減少的情況下,人們逐漸把注意力轉(zhuǎn)向植物組織培養(yǎng)技術(shù)。我國的藥用植物組織培養(yǎng)的研究是在20世紀(jì)70年代以后迅猛發(fā)展起來的。目前藥用植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用主要在：快速繁殖、無病毒苗生產(chǎn)、選育新品種、種質(zhì)資源保存、次生代謝物的生產(chǎn)幾個領(lǐng)域。1藥用植物快速繁殖在人工栽培藥用植物中，有不少名貴藥用植

3、物，如：人參、黃連、黑節(jié)草等，生產(chǎn)周期很長，如果常規(guī)方法育種或育苗，則需要花費(fèi)很長時(shí)間；另一些藥用植物則繁殖系數(shù)小，耗種量大，嚴(yán)重影響了發(fā)展速度并增加了生產(chǎn)成本，如；貝母、番紅花等；還有一些藥用植物，如：地黃、太子參等，由于病毒為害而退化，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)；一些進(jìn)口南藥因種苗奇缺而影響擴(kuò)大生產(chǎn)，如：乳香等。而藥用植物生產(chǎn)需求大量規(guī)格統(tǒng)一、性狀優(yōu)良的苗木，這一目標(biāo)可以通過組織培養(yǎng)手段實(shí)現(xiàn)。利用組織培養(yǎng)法每年可繁殖出幾萬至數(shù)百萬倍的小幼苗，如：苦丁茶每株試管苗每次繼代培養(yǎng)繁殖5倍，按平均每40天切割繼代一次計(jì)算，每年可繼代9次，每株苗理論上可繁殖出將近200萬株苗。因此，組織培養(yǎng)對于因病毒病害

4、嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量的藥用植物、靠有性繁殖提供種子而種子發(fā)育不完善或種子成本高的藥用植物、靠無性繁殖提供“種子”而無性繁殖系數(shù)低且種子需求量大的藥用植物、瀕危或?yàn)l危藥用植物的引種馴化以保護(hù)植物資源等具有重要的科研和生產(chǎn)意義。目前，通過組織培養(yǎng)成功的藥用植物至少有200種。培養(yǎng)的藥用植物從常見的到珍稀瀕危植物、民族植物，如云南黑節(jié)草、延齡草、高山紅景天，藏藥川西獐芽菜、莪術(shù)、水母雪蓮、星花鄉(xiāng)線菊、溪黃草、玉葉金花、遼東蔥木等。從生產(chǎn)常用藥的植物到具有抗癌、抗病毒等有效成分的植物，如紅豆杉、艾黃楊、狼毒、大戟屬、長春花、米仔蘭、狗牙花和香榧等。培養(yǎng)用的材料也有提高。開始以草本、木本或藤本植物的根、莖

5、、葉、花、胚、果實(shí)、種子、髓、花藥等組織或器官進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)展到從器官誘導(dǎo)到愈傷組織、細(xì)胞培養(yǎng)，再發(fā)展為用冠癭組織、毛狀根進(jìn)行培養(yǎng)2。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷提高，從固體、液體靜態(tài)、懸浮培養(yǎng)，到深層大罐發(fā)酵、液體連續(xù)培養(yǎng)和細(xì)胞固定化培養(yǎng)等。最近人們對植物組織培養(yǎng)電刺激效應(yīng)進(jìn)行了探討，應(yīng)用誘導(dǎo)劑、稀土和體外脅迫等對植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生藥物成份進(jìn)行了研究。在組織培養(yǎng)過程中也建立了一些相應(yīng)的技術(shù)，如放射免疫測定法、復(fù)制平板技術(shù)、微滴試驗(yàn)、熒光顯微鏡術(shù)和高效液相色譜法，對篩選和獲得高產(chǎn)細(xì)胞株非常重要。目前，藥用植物種苗的快速繁殖途徑主要有以下兩種：11無性植株的再生無性植株的再生是植物通過組織培養(yǎng)和遺傳工程進(jìn)行

6、品種改良的一個先決條件,也是實(shí)現(xiàn)獲得大量人工種苗的重要途徑。目前我國藥用植物用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖的無性系可概括為以下幾個方面：（1）帶節(jié)莖段扦插快繁，即由帶節(jié)莖段在無菌條件下扦插，可以進(jìn)行快速無性繁殖，如黃芩、羅布麻、款冬等；（2）器官發(fā)生，細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)通過不定芽形成植株，如枸杞、雪蓮花、西洋參、延胡索、毛地黃、丹參、黃連、川白芷、栝樓、中麻黃、西紅花、枳殼、長春花等已通過這種方式建立了無性繁殖系，得到了人工種苗；（3）類胚體途徑，細(xì)胞或愈傷組織通過胚狀體途徑，即經(jīng)過球形胚期、心形胚期、魚雷胚期、子葉胚期經(jīng)成熟胚的類胚體上，還能繼續(xù)不斷地形成新的胚狀體，如西洋參、人參、甘草、三七、黃連、刺

7、五加等；（4）原球莖，細(xì)胞或組織培養(yǎng)經(jīng)過原球莖途徑分化形成植株，如鐵皮石斛、百合等3。12胚的離體培養(yǎng)獲得人工種苗胚培養(yǎng)可以克服有性雜交中的胚乳敗育、早期胚敗育和珠心胚干擾等獲得雜種苗，此項(xiàng)技術(shù)已進(jìn)入實(shí)用階段，西洋參、紅花、枳殼、長春花、鼓槌石斛、銀杏等植物的胚培養(yǎng)已獲成功。王麗4等對香雪蘭離體胚培養(yǎng)研究表明，離體胚培養(yǎng)不僅可打破種子的休眠，而且可以解決遠(yuǎn)緣雜種不能正常發(fā)育的難題。李志良5對中國紅豆杉和短葉紅豆杉的離體胚培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)適宜的條件下兩種胚萌發(fā)率與成苗情況沒有明顯的差異，離體胚培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模種植的一條快捷途徑。2 藥用植物無病毒苗的生產(chǎn)1952年，Morel和Marti

8、n首次證實(shí)，通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，可以獲得無病毒的大麗菊植株，證實(shí)了組織培養(yǎng)技術(shù)對于植物脫病毒的優(yōu)異作用。采用莖尖培養(yǎng)脫毒的原理是：在感染病毒植物體內(nèi)，病毒分布并不均等。在生長點(diǎn)病毒含量最低，侵染的病毒使寄主代謝異常，因此造成植物生長的抑制，或形成畸變，產(chǎn)生皺縮、花葉、雜斑等到許多癥狀，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降，以及花變小，色澤暗淡，產(chǎn)量少等品種退化的現(xiàn)象。如唐菖蒲、百合、地黃、太子參等都存在這樣的問題。采用莖尖培養(yǎng)支病毒后，植株生長勢強(qiáng)，抗逆能力提高，品質(zhì)和產(chǎn)量均明顯增強(qiáng)。例如，唐菖蒲侵染了黃瓜花葉病毒（CMV）后，植物葉面形成斑紋，而黃色花葉病毒（BYMV）則使侵染后的植物花帶斑點(diǎn)，并扭曲

9、畸變。王慧芳6（1991）報(bào)道將帶有CMV和BYMV病毒的唐菖蒲球莖切取莖尖0.5mm,經(jīng)愈傷組織的培養(yǎng)，脫分化，分化出根、芽后，獲得完整植株，經(jīng)鑒定，成株不帶CMV和BYMV病毒。據(jù)研究資料表明，去病毒苗的比例高低取決于病毒種類，植物種類及操作技術(shù)。例如，百合經(jīng)處理后，去病毒的百合比例為16%25%，唐菖蒲花瓣組織培養(yǎng)去煙草花葉病毒的比例為30%50%7。3藥用植物新品種的培育植物組織培養(yǎng)技術(shù)已成為培育新種質(zhì)的新手段之一。在藥用植物上研究和應(yīng)用的方向主要有三個方面。3.1 單倍體和多倍體培養(yǎng)單倍體經(jīng)染色體加倍后成為純系，使突變性狀易于表現(xiàn)出來。而且基因重新組合對于的藥用植物而言，可以通過酶的

10、作用影響到一系列蛋白質(zhì)合成及其各種性狀，通常具有較高含量的藥用成分，同時(shí)增強(qiáng)了植株的生態(tài)適應(yīng)性及對逆境的抗耐性。因此單倍體和多倍體培養(yǎng)技術(shù)，對于品種選育，改良及遺傳分析有重要意義。攀映漢8對寧夏枸杞含單核晚期花粉的花藥培養(yǎng)，得到來自花粉的單倍體植株。曹有龍31等用枸杞花粉愈傷組織懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體也獲得了單倍體植株。而以寧夏枸杞未受粉的子房為材料，可獲得四倍體和非整倍體植株，其中誘導(dǎo)出的同源四倍體枸杞表現(xiàn)出花和果實(shí)大、種子少的特點(diǎn)，充分顯示出其潛在價(jià)值。高山林9等研究多倍體性狀與藥材質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)不同類型丹參多倍體根中丹參酮的含量不同，叢根類型的丹參多倍體品系不僅產(chǎn)量增加，而且丹參酮含量平均比對照

11、增加79%，這樣使多倍體巨大性和藥用成分含量兩個方面得以較理想的組合和統(tǒng)一。目前利用單倍體和多倍體培養(yǎng)技術(shù)培育得到新品種的藥用植物有黨參、黃芪、丹參、枸杞、薄荷等10，其中部分品種已產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。3.2 原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)是藥用植物生物工程的基礎(chǔ),通過原生質(zhì)體培養(yǎng)篩選高產(chǎn)細(xì)胞系、細(xì)胞雜交、以原生質(zhì)體作為受體系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)都依賴于植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)、融合和植株再生技術(shù)。自從植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生以來，許多經(jīng)濟(jì)植物，特別是重要農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、甘蔗、大豆等的原生質(zhì)體培養(yǎng)工作已廣泛開展并取得了相當(dāng)大的進(jìn)展11，但原生質(zhì)體培養(yǎng)在藥用植物上的應(yīng)用相對滯后。

12、從目前的研究進(jìn)展來看，枸杞、峨?yún)?、決明、防風(fēng)、人參、龍膽、絞股藍(lán)、川芎、前胡等已實(shí)現(xiàn)了以原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得愈傷組織或再生植株。劉寶12等用黃花煙草葉片愈傷組織和寧夏枸杞下胚軸愈傷組織培養(yǎng)分離獲得原生質(zhì)體并進(jìn)行融合，實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)緣遺傳物質(zhì)交流，獲得雜種小苗。這為探索通過原生質(zhì)體融合技術(shù)將枸杞中決定藥用成分的基因轉(zhuǎn)移到重要經(jīng)濟(jì)作物煙草中奠定了基礎(chǔ)。3.3 基因工程中轉(zhuǎn)化體系的建立 基因工程是利用重組DNA技術(shù)，在體外通過人工剪切和拼接等方法，對生物基因進(jìn)行改造和重新組合，導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，生產(chǎn)所需要的基因產(chǎn)物。植物轉(zhuǎn)基因的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法、基因槍法、花粉管通

13、道法等,前兩種方法需要通過組織培養(yǎng)再生植株,我國學(xué)者多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法。據(jù)報(bào)道，迄今所獲得的200種轉(zhuǎn)基因植株中80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)產(chǎn)生的13。在組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化體系建立的基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，引入控制某種性狀的基因，對藥用植物進(jìn)行有效的遺傳轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到提高有效成分含量、增強(qiáng)植株抗性和品質(zhì)、抗除草劑等目的。邱璐等14對燈盞花遺傳轉(zhuǎn)化中的組織培養(yǎng)受體系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)使用75g/ml的chl(氯霉素)作為土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的選擇壓力, 使用50g/ml的Gent(慶大霉素)作為轉(zhuǎn)基因植株的選擇壓力,使用300g/ml的cef(頭孢霉素)作為土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因的抑菌抗生素

14、,對燈盞花遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳。在轉(zhuǎn)化體系建立的基礎(chǔ)上，結(jié)合土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法，有望獲得轉(zhuǎn)基因燈盞花。王慧中等15已成功地將外源卡那霉素抗性基因通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入了寧夏枸杞的幼莖外植體，所獲得的再生植株經(jīng)胭脂堿檢測、NPT-II活性測定及Southem分子雜交，證明外源基因NPT-II及胭脂堿合成酶基因，已整合到枸杞細(xì)胞的核基因組上，并能在植株水平上表達(dá)出相應(yīng)的性狀。目前我國已在甘草、丹參、黃芪、表蒿、紅豆杉等多種植物藥材中建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，一些相關(guān)的關(guān)鍵基因已克隆，通過基因工程操作，可使這些基因過度表達(dá)，就有望增加有效成分的含量16。4 藥用植物的離體種質(zhì)保存

15、植物種質(zhì)資源是物種進(jìn)化，遺傳研究及植物育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是人類生存與持續(xù)發(fā)展的基本條件。目前，全世界面臨著環(huán)境污染和熱帶森林資源的破壞，平均每天有2種植物從地球上消失，這是全人類物種財(cái)富的損失17。而在生物科學(xué)迅速發(fā)展的今天，擁有種質(zhì)資源的多少以及對其研究的深度和廣度，對于未來生物科學(xué)的研究和生產(chǎn)起著極其重要的作用。因此，許多國家目前都有專門搜集保存資源的種子庫，但保存種質(zhì)資源占地多，維持費(fèi)十分高昂?，F(xiàn)在可借助試管來保存它們。試管保存就是在人為控制條件下，利用組織培養(yǎng)技術(shù)保存種質(zhì)資源。與傳統(tǒng)的保存植物種質(zhì)資源的方法種子庫相比，采用植物細(xì)胞、組織或器官，能最大限度地抑制生理代謝強(qiáng)度，降低劣變發(fā)生

16、頻率，達(dá)到長期保存種質(zhì)的目的。實(shí)驗(yàn)證明，植物組織甚至細(xì)胞可以在4低溫或在液氮的低溫中貯存幾個月或幾年不喪失其活力，這為保持植物資源和對植物材料運(yùn)輸提供了方便18，越來越多的種質(zhì)資源和生物制品可在離體條件下運(yùn)輸，由于沒有昆蟲，細(xì)菌和真菌感染，因而在許多口岸獲得免檢19。史永忠20等研究鐵皮石斛種質(zhì)資源的低溫保存時(shí)，發(fā)現(xiàn)其試管苗能在4黑暗條件下連續(xù)保存12個月，并能正常生長。陳品良21等用杜仲的花粉在液氮（-196）中保存，實(shí)現(xiàn)了花粉粒的萌發(fā)。李明軍22等用懷山藥的無菌苗進(jìn)行離體誘導(dǎo)，形成微型塊莖，發(fā)現(xiàn)微型塊莖是懷山藥離體繁殖和種質(zhì)保存的又一途徑，這將有助于種質(zhì)資源的保存和交流。目前，離體種質(zhì)保存

17、雖已進(jìn)入了較長時(shí)間的研究，但因其本身的局限性或技術(shù)上的不成熟而在實(shí)際應(yīng)用中受到極大限制。相對而言，超低溫保存卻顯示了其廣闊前景，但長期使用凍存材料可使其再生能力衰退、組織培養(yǎng)后代遺傳穩(wěn)定性等仍未解決的問題還有待于進(jìn)一步研究。5 藥用植物次生代謝物的生產(chǎn)在植物組織培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞中含有各種特殊的代謝產(chǎn)物、藥用成分和各種香精等。其中有些是微生物；有些是人工所不能合成的物質(zhì)；有些是整體植物中含量甚微或整株植物十分缺乏，而培養(yǎng)細(xì)胞中的含量卻很高，如人參皂苷在組織培養(yǎng)中中含量占干重的27%,全株中只有4.5%,紫草素在細(xì)胞培養(yǎng)物是占有2%,而全株只有1.5%。因此，以培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)這些有用成分已受

18、到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及商業(yè)界人士的極大關(guān)注。通過愈傷組織或懸浮細(xì)胞的大量培養(yǎng)，從細(xì)胞或培養(yǎng)基直接提取藥物，或通過生物轉(zhuǎn)化、酶促反應(yīng)生產(chǎn)藥物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前通過各種培養(yǎng)物中產(chǎn)生的藥用成分已有600多種,其中40多種化合物在數(shù)量上超過或等于原植物中的含量23。從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到的有用物質(zhì)有：酶類（淀粉酶、淀粉酶、蛋白水解酶、過氧化氫酶、酸性磷酸化脂、糖苷酶、IAA氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶等）；甾體（地奧甙元、育努皂甙元等）；萜類（角鯊烯、羊毛甾醇、環(huán)阿屯醇、人參三醇、人參二醇、油烷酸、人參甙等）；生物堿（麻黃堿、利血平、吲哚生物堿、麥角堿等）；苷類（人參皂苷、三七皂苷、甘草甜苷、薯蕷皂苷等）、色素

19、（大黃素、紫蘇寧、紅花素、蒽醌、紫草素等）等24 25。1964年，羅士韋首先成功地進(jìn)行了人參的組織培養(yǎng)，隨后我國和其他國家的一些學(xué)者將人參的組織培養(yǎng)過渡到工業(yè)化生產(chǎn)。目前我國學(xué)者已建立了三七、三分三、人參、西洋參、紫草、長春花、丹參、紅豆杉等十幾種藥用植物的液體培養(yǎng)系統(tǒng)，經(jīng)過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的操作已使有用成分達(dá)到或超過原植株。并實(shí)現(xiàn)了人參10L體積的大規(guī)模培養(yǎng)，對其培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)成分和藥理活性比較分析，表明與種植人參無明顯差異，并已作為美容保健品投放市場，這是我國藥用植物生物技術(shù)產(chǎn)品商品化的第一個范例26。參考文獻(xiàn) 1許繼宏，馬玉芳，陳銳平等. 藥用植物組織培養(yǎng)技術(shù)M. 北京：中國農(nóng)業(yè)科

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