中藥黃斑顆粒對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷的防護(hù)作用

1、 中藥黃斑顆粒對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷的防護(hù)作用71.9642.3047.2327.7520.1926.23V。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。a、b波潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：中藥復(fù)方制劑黃斑顆粒對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷在形態(tài)和功能上有明顯的防護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  黃斑顆粒; 視網(wǎng)膜電描記術(shù); 光損傷; 視網(wǎng)膜變性; 大鼠    Methods: A total of 24 male SpragueDawley (SD) rats were randomly divided into normal control group, untreated

2、group and Huangban Granule group. Retinal light damage was induced by exposure to constant white fluorescent light for 5 hours at an illumination of 2 800 Lux. The Huangban Granule was given 10 days before light exposure until the animals were sacrificed in Huangban Granule group, and an equal volum

3、e of distilled water for the rats in untreated group. Electroretinogram (ERG) was recorded in all animals 2 weeks after light exposure and the animals were sacrificed for histopathological examination of retina. The outer nuclear layers (ONLs) 1.35) (P<0.01). B71.96) 42.30) V in Huangban Granule

4、group and the untreated group respectively (P<0.01). A47.23) 27.75) 20.19) 26.23) V (P<0.01) respectively in the two group. There was no significant difference in implicit times of awave and bwave among the three groups.    Conclusion: Huangban Granule obviously protects both fu

5、nction and morphology of the retina from lightinduced retinal damage in rats.    Keywords: Huangban granule; electroretinography; light damage; retinal degeneration; rats    視網(wǎng)膜容易受到光照的影響，光對(duì)視網(wǎng)膜的損傷有蓄積作用，目前過(guò)量的光線暴露可以誘導(dǎo)白化大鼠視網(wǎng)膜光感受器變性13，細(xì)胞凋亡是主要的表現(xiàn)方式35。流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)多暴露于太陽(yáng)光可能與年齡相關(guān)

6、性黃斑變性有關(guān)6。而對(duì)于視網(wǎng)膜變性類(lèi)疾病的治療也一直是普遍關(guān)注的問(wèn)題，光損傷誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性動(dòng)物模型與視網(wǎng)膜變性類(lèi)疾病有相似的病理表現(xiàn)，因而常用于此類(lèi)疾病的機(jī)制與治療研究。    研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)視網(wǎng)膜的光損傷有一定的防護(hù)作用，如丹參、枸杞等具有對(duì)抗視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的作用7, 8。本實(shí)驗(yàn)中黃斑顆粒是自制復(fù)方中藥顆粒沖劑，臨床應(yīng)用10多年，主要用于年齡相關(guān)性黃斑變性以及其他各類(lèi)視網(wǎng)1膜變性類(lèi)疾病。本研究通過(guò)建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型，用中藥復(fù)方制劑黃斑顆粒灌胃的方法，觀察它對(duì)光誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷形態(tài)與功能的防護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)。  

7、  1  材料和方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料    1.1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  雄性SD大鼠24只，清潔級(jí)，體質(zhì)量190210 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK滬200730 g/60 kg3.125 g/kg，將藥物溶解于2 ml蒸餾水中，1次/d灌胃。模型組同時(shí)開(kāi)始喂蒸餾水2 ml，1次/d，正常對(duì)照組不予特殊處理。    1.2.2  模型制作方法  參考文獻(xiàn)方法10，所有動(dòng)物均在12 h明光照強(qiáng)度300

8、lx，8：0020：0012 h暗5 Lux，20：008：00交替、溫度為2225 ，濕度為55%60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。在光照開(kāi)始前24 h進(jìn)行暗適應(yīng)，光照前30 min在暗紅燈下滴1%阿托品擴(kuò)瞳后，放入自制的光照箱，采用白色熒光燈管，光照強(qiáng)度平均為2 800150lx光照度計(jì)為Kyoritsu5202，日本共立儀器公司。持續(xù)照射5 h18：0023：00，箱內(nèi)溫度為2326 ，光照結(jié)束后放于暗環(huán)境中飼養(yǎng)，喂藥組及模型組分別繼續(xù)灌胃。    1.2.3  雙眼視網(wǎng)膜電流圖檢測(cè)  在光照后第14天行雙眼視網(wǎng)膜電流圖electroretinogra

9、m, ERG檢測(cè)，暗適應(yīng)過(guò)夜，檢測(cè)前用速眠新846合劑，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所麻醉，美多麗復(fù)方托吡卡胺滴眼液，MydrinP擴(kuò)瞳，0.5%丁卡因角膜外表麻醉，用德國(guó)Roland視覺(jué)電生理儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄電極采用自制的環(huán)形不銹鋼絲置于角膜中央，參考電極和地電極采用不銹鋼針，分別置于兩頰和尾部皮下，操作在暗紅燈下5 lx進(jìn)行。記錄暗適應(yīng)眼的最大反響通頻帶0.2300 Hz，標(biāo)準(zhǔn)白色閃光3.0 cds/m2，平均2次，間隔10 s和振蕩電位通頻帶75300 Hz，標(biāo)準(zhǔn)白色閃光3.0 cds/m2，疊加4次，間隔15 s。分別測(cè)量最大反響的a波和b波的潛伏期ms及振幅V，振蕩電位oscillat

10、ory potentials, OPs總振幅V。雙眼取平均值為1個(gè)個(gè)體。    1.2.4  視網(wǎng)膜石蠟切片制作及染色  記錄ERG后用10%水合氯醛過(guò)量處死大鼠，于角膜12：00處縫線做標(biāo)記，取雙眼球固定于10%中性福爾馬林固定液中，24 h后過(guò)縫線與視神經(jīng)做矢狀切片，然后梯度濃度酒精脫水，石蠟包埋，切片4 m，蘇木素和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡德國(guó)Leica公司下觀察形態(tài)改變并拍照。拍照部位為距離視盤(pán)上方1.52 mm處。分別計(jì)數(shù)距離視盤(pán)上、下睫狀體緣0.54.5 mm，每隔0.5 mm處的感光細(xì)胞核層數(shù)。    1

11、.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  所有數(shù)據(jù)以xs表示，采用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)資料的方差分析，兩兩比擬采用SNKt法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)1.35，黃斑顆粒組層數(shù)明顯比模型組增多，3組之間比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。見(jiàn)圖2。    2.2  ERG的變化  模型組大鼠視網(wǎng)膜光照后14 d ERG顯示，振幅明顯降低P0.01，黃斑顆粒組雖比正常對(duì)照組有局部降低P0.05，但高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。見(jiàn)表1。表1  大鼠光照14 d后ERG的變化    3&n

12、bsp; 討  論    年齡相關(guān)性黃斑病變和視網(wǎng)膜色素變性等變性類(lèi)視網(wǎng)膜疾病，是嚴(yán)重的致盲性眼病，光感受器細(xì)胞的凋亡是其主要的表現(xiàn)，其開(kāi)展過(guò)程與視網(wǎng)膜的光化學(xué)損傷密切相關(guān)。光照會(huì)加重視網(wǎng)膜變性的進(jìn)程，其機(jī)制可能是活性氧、自由基造成的視網(wǎng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷從而激發(fā)視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡過(guò)程。環(huán)境光和人造光源的應(yīng)用，如眼科光學(xué)檢查及手術(shù)儀器光源，對(duì)視網(wǎng)膜的損傷，都是潛在的威脅。光損傷動(dòng)物模型的建立使人們對(duì)這一病理現(xiàn)象進(jìn)行了較多深入的研究，由于這一模型與人類(lèi)一些視網(wǎng)膜變性疾病有相似的病理過(guò)程，因而對(duì)其損傷機(jī)制、藥物治療等的研究一直是眼科重要的課題1114。 &nbs

13、p;   正常眼介質(zhì)角膜、房水、晶狀體和玻璃體至少可以傳遞1%波長(zhǎng)在4001 400 nm的放射光線，而這局部光線對(duì)視網(wǎng)膜是有損害的。不同波長(zhǎng)的光對(duì)視網(wǎng)膜組織的損傷機(jī)制不同，主要有機(jī)械損傷，光凝作用，光化學(xué)損傷，其中光化學(xué)損傷起著相當(dāng)重要的作用11, 12。既往研究證實(shí)視網(wǎng)膜光損傷模型是一種氧化應(yīng)激模型，與自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)，屬于一種光化學(xué)損傷11, 15。光照射視網(wǎng)膜引起組織發(fā)生過(guò)氧化反響,光感受細(xì)胞的外節(jié)是體內(nèi)含長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸最高的組織，這些長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸具有易受自由基攻擊的亞甲基結(jié)構(gòu)，對(duì)過(guò)氧化物極敏感，易與OH反響形成脂質(zhì)自由基，并攻擊其他不飽和脂肪酸引起連鎖

14、反響，使核膜、盤(pán)膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，最終導(dǎo)致這些生物膜溶解和破壞，造成視網(wǎng)膜光損傷。    視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力主要依賴(lài)于內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)和視網(wǎng)膜色素上皮以及視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子16, 17，但如果自由基生成量超過(guò)了機(jī)體去除能力時(shí)，細(xì)胞將受到損害。研究說(shuō)明外源性抗氧化劑對(duì)光損傷后視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用18。黃斑顆粒具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎益肝、生精養(yǎng)血通絡(luò)之成效，其中不乏抗氧化19以及改善微循環(huán)的單味成分，但復(fù)方制劑成分較復(fù)雜，可能是通過(guò)去除自由基抗氧化抗凋亡而發(fā)揮作用，其具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。    本研究

15、中我們采用自制的光損傷箱，成功建立了SD大鼠光損傷模型，穩(wěn)定性較好，視網(wǎng)膜的損傷有明顯的區(qū)域選擇性，在本研究中以上方視網(wǎng)膜損傷最重，見(jiàn)圖2模型組所示。在光照后第14天，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)到視網(wǎng)膜此區(qū)域明顯的外段損傷，外顆粒層數(shù)目減少，而在黃斑顆粒組那么形態(tài)相對(duì)保存完好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在圖2中，能夠較為形象直觀地看到視網(wǎng)膜外核層距離視乳頭不同點(diǎn)處的層數(shù)變化情況，在黃斑顆粒組各部位均得到較好的保存，與模型組相比，尤其在上方部位，黃斑顆粒組的外核層數(shù)未見(jiàn)明顯喪失，說(shuō)明黃斑顆粒能明顯對(duì)抗大鼠視網(wǎng)膜光損傷，具有較明顯的防護(hù)作用。    ERG是眼科常用的評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能的客

16、觀方法，a涉及b波綜合反映了視網(wǎng)膜外層、內(nèi)層的功能狀態(tài)，OPs那么與視網(wǎng)膜內(nèi)層的微循環(huán)狀態(tài)密切相關(guān)。研究說(shuō)明，黃斑顆粒組ERG各波的振幅明顯高于模型組，說(shuō)明黃斑顆粒對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷后視網(wǎng)膜內(nèi)外層以及微循環(huán)功能狀態(tài)有一定的防護(hù)作用。    本研究結(jié)果說(shuō)明，黃斑顆粒能有效抑制大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的變性，同時(shí)在一定程度上保存視網(wǎng)膜的形態(tài)和功能，延緩病變的進(jìn)展，為臨床治療視網(wǎng)膜變性類(lèi)疾病提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Noell WK, Walker VS, Kang BS, et al. Retinal damage by light in rats.

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