免疫電鏡技術運用過程中電子染色方法的選用

1、免疫電鏡技術運用過程中電子染色方法的選用         08-07-07 10:41:00     編輯：studa20            作者：趙承軍，張東梅，鄧其躍，陳鵬慧，蔡文琴，陶忠芬，張吉強  【摘要】  目的 探究免疫電鏡不同染色方法對免疫組化陽性實驗結果影響的關系。方法 組織切片經(jīng)常規(guī)免疫組化（雌激素受體GPR30）并行DAB-

2、硫酸鎳銨顯色后進行電鏡切片，然后分為雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染、雙氧鈾單染與未染色3組，以便對不同電子染色結果進行比較。結果 GPR30免疫陽性產(chǎn)物位于細胞核外的膜性結構上，在鈾-鉛雙染組顯示很高的電子密度，但是背景染色也很深，在鈾單染組的反差比較好，而未染色組的反差更好。結論 免疫電鏡技術中針對不同的免疫陽性反應選用不同的電子染色方法，有利于陽性結果的判斷與鑒別。 【關鍵詞】  免疫電鏡技術；雌激素受體；海馬；電子染色Abstract: Objective   To explore different immunoelectronic staining methods

3、 on the ultralocalization of immunohistochemistry. Methods   The novel membrane receptor GPR30 immunohistochemistry with DAB-nickel intensification was applied, then ultrathin sections were prepared and different eletronic staining (citric lead plus dioxydate uranium, dioxydate uranium-onl

4、y or no electrostaining) was carried out. Results   Under light microscope, GPR30 showed very strong immunoreactivity in the hippocampal pyramidal neurons. Under electronic microscope, the blank staining (no electrostaining) sections showed the highest contrast, while the double staining s

5、ections showed the lowest contrast. Conclusion   For different immunoreactive intensity, different electronic staining was suggested.    Keywords: immunoelectronic microscope; estrogen receptor; hippocampus; electronic staining免疫電鏡標記技術已廣泛應用于生物學的各個方面1-2，它能在超微結構水平上精確、細致地定位，特異性

6、高，方法簡便，優(yōu)越性十分顯著。而如何能成功確定免疫反應陽性區(qū)域并選取合適的區(qū)域是免疫電鏡成敗的關鍵。為此我們應用免疫電鏡技術但選用不同的電子染色方式，以比較幾種電子染色的優(yōu)缺點，從而為免疫電鏡技術的開展提供一些參考。1  材料與方法1.1  動物及分組    成年雌性SD大鼠共12只，體重（210±10）g，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。隨機分為實驗組（加抗體組）和空白對照組（不加抗體的陰性對照），實驗組又分雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色、雙氧鈾單染與未染色三組進行對比觀察。1.2  主要試劑和藥品  

7、0; 羊抗兔GPR30（ab12563）多克隆抗體購自英國Abcam公司，抗體稀釋液（antibody diluent with background-reducing, S302281）與羊抗兔EnVisionTM試劑盒（GK400305）購自Dakocytomation公司，封閉血清、DAB顯色試劑盒等購自北京中杉公司，其余試劑均為市售分析純。1.3  儀器設備    TECNAI-10型透射電子顯微鏡（PHILIPS公司），超薄切片機（LKB公司）。1.4  免疫組織化學染色1.4.1  動物固定、取材  &

8、#160; 動物用5%水合氯醛麻醉，開胸，經(jīng)左心室插管到主動脈，剪開右心耳，先后灌注生理鹽水200 mL和4%多聚甲醛溶液300 mL。灌注后取出大腦組織，分離海馬放入2.5%戊二醛溶液。然后用振蕩切片機制備海馬切片（片厚100 m），切片入2.5%戊二醛溶液后固定2 h，用0.01 mol/ L PBS pH為7.27.4洗滌3次，每次1 h，最后保存于4 備用。1.4.2  包埋前免疫電鏡步驟    按文獻3-4進行。簡述如下：3%H2O2封閉15 min，0.01 mol/L PBS漂洗后，用正常山羊血清封閉30 min，然后加入一抗（GPR30，

9、1200）于4 孵育過夜。PBS漂洗后加入羊抗兔EnVisionTM試劑，室溫1 h，0.01 mol/L PBS漂洗后用硫酸鎳銨-DAB顯色5 min。在解剖顯微鏡下選取免疫陽性反應區(qū)域，修成0.1 mm×0.1 mm×1 mm大小，放入0.01 mol/L的PBS，經(jīng)1%鋨酸后固定、丙酮梯度常規(guī)脫水、環(huán)氧樹脂618包埋、半薄切片定位后，70 nm 超薄切片撈于有支持膜的200目鎳網(wǎng)上，按實驗分組進行電子染色，透射電子顯微鏡觀察拍照。空白對照用PBS取代一抗，其它步驟相同。有DAB顆粒沉積者為陽性。2  結果    在光鏡下，GPR30免疫陽性產(chǎn)物清楚地位于海馬椎體神經(jīng)元的核外區(qū)域，但是由于神經(jīng)元的細胞核體積較大，免疫陽性產(chǎn)物究竟在細胞膜或胞漿內(nèi)難以明確。在透射電鏡下觀察，大鼠海馬神經(jīng)元細胞超微結構清晰，形態(tài)保存基本良好。實驗組海馬神經(jīng)元中均出現(xiàn)電子密度高的顆粒，呈小團狀或點狀分布于細胞內(nèi)，主要位于粗面內(nèi)質網(wǎng)，也可定位于線粒體及胞漿中的膜性結構上。在鈾-鉛雙染組可見很深的免疫陽性產(chǎn)物，顆粒成團密集、著色很深，但是其背景染色也較深（圖1a），鈾單染組也有較好的染色背景，其免疫陽性顆粒更清楚（圖1b）。未經(jīng)電子染色組免疫陽性反