基于微流控芯片的小型流式細胞儀研究

1、浙江大學理學院碩士學位論文基于微流控芯片的小型流式細胞儀研究姓名：葉曉蘭申請學位級別：碩士專業(yè)：分析化學指導教師：方群20080501浙江入學碩上學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得逝鎏盤堂或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文學名葉嗌乙簽字吼硝年學位論文版權使用授權書月弓日本學位論文作者完全了解迸鎏盤堂有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向

2、國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權逝姿態(tài)堂可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。（保密的學位論文在解密后適用本授權書）學位論文作者簽名。葉戰(zhàn)飆晰鄉(xiāng)月鄉(xiāng)日日學位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：導師簽名：簽字目郵編：電話：月留摘要隨著微流控芯片加工技術逐漸普及和微流控分析方法研究的不斷深入，微型全分析系統(tǒng)（，）已將分析實驗室的部分功能轉移到便攜化的分析設備中，為化學分析設備的微型化與集成化提供了基礎，最終可以實現(xiàn)分析實驗室的“個性化、“家用化”，使分析儀器從化學實驗室解放出來，進入千

3、家萬戶。本研究組在年提出了應用于微流控芯片的正交型激光誘導熒光檢測光路新模式，具有光路結構簡單，易于搭建的特點。該檢測模式曾被用于構建微流控芯片流式細胞分析裝置，該實驗中，在熒光微球前向小角度（）方向上檢測前向光強度的變化，實現(xiàn)了芯片上熒光微球的計數(shù)功能；利用芯片側壁作為采集面，實現(xiàn)熒光微球熒光的同時采集。在上述工作基礎上，本文進一步進行了正交光路激光誘導熒光檢測一芯片流式細胞分析儀的小型化研究。該儀器具有儀器結構簡單、體積小、試樣消耗量少、價格低廉等優(yōu)點。第一章，對流式細胞儀原理和基于微流控芯片的流式細胞儀的發(fā)展進行了綜述。第二章，基于芯片正交光路檢測模式，搭建了一套小型的微流控芯片流式細胞

4、儀。以小型半導體激光器作為激發(fā)光源，激光束被透鏡聚焦于芯片通道中央，采用光電二極管檢測芯片通道內流動細胞的前向散射光信號，采用小型光電倍增管檢測熒光信號，整套儀器體積為（長度×寬度×高度），具有結構簡單、體積小、價格低廉等特點。熒光檢測系統(tǒng)對四甲基羅丹明異硫氰酸的檢測限為，采用岬熒光微球作為模型樣品考察了儀器的分析性能，同時初步實現(xiàn)了細胞樣品的分析。關鍵詞：微流控芯片，正交光路檢測，流式細胞儀，（），（）（）一（），：，浙江大學碩士學位論文第一章微流控芯片上流式細胞儀的研究第一章微流控芯片上流式細胞儀的研究流式細胞儀的基本概念及工作原理流式細胞儀的發(fā)展凝結了半個世紀以來科學

5、家的心血和成果，是一項有多年歷史的【，、發(fā)展迅速的生物醫(yī)學分析技術【。年，提出了一個設想：使懸浮的單個血紅細胞通過一根玻璃毛細管，用光電儀記錄通過的細胞數(shù)量，他是世界上最早試圖使細胞檢測自動化的人。年，根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律設計了流動室，奠定了現(xiàn)代流式細胞術中的液流技術基礎。年，在多年科學研究的基礎上，利用效應生產(chǎn)了計數(shù)器。隨后經(jīng)、和等的不斷努力，完成了計算機與儀器的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析，開創(chuàng)了細胞的免疫熒光染色及檢測技術，將流式細胞儀推向了臨床方面。隨著儀器和方法不斷完善，人們將更多的精力投向樣品的制備，細胞染色方法和軟件開發(fā)等方面，從而擴大流式細胞儀的使用效果和應用范圍

6、。流式細胞儀的概念與構造流式細胞儀（，）是對高速直線流動的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術、細胞的計數(shù)和分選技術，計算機對數(shù)據(jù)的采集和分析技術等，基本結構見圖。它作為測量細胞表面標記、形態(tài)特征、內部結構的精密儀器在實驗室中得到了廣泛的應用。流式細胞儀是以流式細胞術為理論基礎，綜合了光學、流體動力學、電子學和計算機控制技術的現(xiàn)代化醫(yī)療應用儀器【】。流式細胞術是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術。雙。，掣”勰，！、二礎岫圈流式細胞儀基本結構】流式細胞儀主要有四部分構成：激光源和光學系統(tǒng)；流動室和液流系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)；計算機和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。其中流動室是儀器的核心部件

7、。（一）光源和光學系統(tǒng)激光是一種相干光源，能夠提供高強度的照射光，穩(wěn)定性強，發(fā)射角度小，能聚焦到細胞尺度，是細胞快速分析的理想光源。流式細胞儀是以氬離子激光器最為普遍，也有使用氪離子激光器或染料激光器的報道。經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測，因此，光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質的激發(fā)光譜而定。光學系統(tǒng)包括各種透鏡、濾光片、分光鏡等，來自細胞的各種信號，如不同角度的散射光、不同波長的熒光等通過這些光學系統(tǒng)分別被送到不同的檢測器。激光光束經(jīng)透鏡聚焦到檢測區(qū)，聚焦得到的激光光斑直徑應和細胞直徑相浙江大學碩上學位論文第一章微流控芯片上流式細胞儀的研究近，這樣可以使細胞得到

8、均勻照射，并且能夠提高分辨率。聚焦光斑直徑可由公式（）確定：（）其中，為光斑直徑；偽透鏡焦距；為激光束直徑；九為激光波長。為了進一步提高熒光訊號的信噪比，在光路中使用了濾片，目前常用的濾光片可以分為三種：截止濾光片，帶阻濾光片和帶通濾光片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一波長區(qū)段的光線濾除或通過，如表示其允許通過波長范圍為。（二）液流系統(tǒng)和流動室主要是由鞘液、細胞懸液和流動室組成。在氣體壓力的作用下，流動室內充滿的鞘液從噴嘴噴出形成鞘液流，細胞懸液在鞘液流的夾帶下和氣體壓力的作用下經(jīng)導管輸入流動室，正對流動室的噴嘴噴射。細胞懸液內的細胞在鞘液流的約束下排列成單列，由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液

9、柱。（三）光電管和檢測系統(tǒng)熒光染色的細胞經(jīng)特定波長的光激發(fā)所產(chǎn)生的熒光，可通過光電轉換器轉變成電信號后進行測量，最常用光電轉換器為光電倍增管（）。的響應時間短，僅為數(shù)量級；光譜響應特性好，在的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)率都比較高。光電倍增管的增益從到可連續(xù)調節(jié)，因此對弱光測量十分有利。但是從輸出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞儀一般備有兩類放大器：線性放大器，即輸出信號輻度與輸入信號成線性關系。適用范圍：較小范圍內變化的信號以及代表生物學線性過程的信號，例如、測量等。對數(shù)放大器，輸出信號和輸入信號之間成常成對數(shù)關系。適用范圍：免疫學，由于免疫分析時時常要同時顯示陰性、陽性和強陽

10、性三個亞群，它們的熒光強度相差個數(shù)量級，用對數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。（四）計算機和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)浙大學碗掣論女第一章微疏拄片±漉武胞儀的”究放大后的電信號被送往計算機，再經(jīng)模一數(shù)轉換器傳輸?shù)轿C處理器進行處理，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數(shù)字信號，計算機把所測量到的各種信號進行處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。流式細胞儀的工作原理經(jīng)熒光染色的細胞懸液由氣壓裝置送入流動室，流動室由鞘流管和樣品管組成，當鞘流液和樣品流達到一定的壓力時，鞘液裹挾著樣品流迫使細胞有序地排列成單列，并以穩(wěn)定的速度同方向經(jīng)過岬

11、的噴嘴，從而確保細胞液流穩(wěn)定，并且垂直通過激光聚焦區(qū)，圖所示。圖流式細胞儀鞘流圖熒光標記的細胞經(jīng)過激光聚焦區(qū)后，產(chǎn)生的信號以細胞為中心，向空間立體角發(fā)射（見圉），這些信號主要為以下幾種：細胞前向散射光信號（，）、散射光信號（！，）和熒光信號（）。新：學“士學位論文第一章徽漉控片流式目胞倥的目究黑：囂微幫”“”“”訾。種雹黜黼然。：橢?！?，、÷：岫。；。甜。，“，汕圖細胞信號圖，一細胞的散射光信號是由細胞的反射、折射和衍射組成的，取決于細胞的大小、形狀和密度等。前向角散射又被稱為小角度散射光信號，角度為，與被測細胞直徑的平方密切相關，對于同一種細胞群體，前向散射光強，則說明細胞體積比較

12、大，前向散射光弱，則表示細胞體積較小。細胞大角度散射光（跖茸，）信號，角度為。，所包含的信息較多，主要包括細胞表面和內部的精細結構以及細胞大小的信息。角散射光對細胞膜、細胞質、核膜的折射率更敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。細胞前向消光度信號是指當光束通過細胞后，在前向方向的能量降低，與細胞的本身吸光性質和散射有關。細胞的前向消光度信號可以反映細胞的體積、活性、胞質內物質含量（如蛋白質含量）等信息。細胞的熒光信號分析是流式細胞術中一個重要的組成部分，熒光強度和細胞內各種組分如、和蛋白質等的含量成正比，通過測定熒光強度就可以知道細胞內各組分的含量。熒光信號有兩種一種是細胞本身的熒光

13、信號，即在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號；第二種是經(jīng)熒光物質標記后的細胞在激光照射下發(fā)出特異性的熒光信號，即選擇不同的熒光染料試劑與細胞膜表面抗原、受體或膜蛋白特異性結合，或穿透細胞膜與胞質內物質結合，在一定波長浙江大學碩士學位論文第一章微流控芯片上流式細胞儀的研究的激光照射細胞后，這些與抗原、蛋白或其它物質結合的染料就會發(fā)出熒光信號。利用這些熒光信號可以對標記的特異性物質進行定性和定量分析，從而實現(xiàn)對細胞亞群功能的測定。以上產(chǎn)生的散射信號和熒光信號可以通過一些濾光片分辨開。散射光是從細胞表面或者細胞內顆粒散射出來的原激發(fā)光譜，其信號較強，用光電二極管即可檢測，但是熒光信號較弱，必須用光電倍增管

14、（）才可檢測。流式細胞儀的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。噴嘴射出的液流柱在流動室的壓電晶體發(fā)出幾十的電信號作用下發(fā)生振動，斷裂形成均勻的液滴，待測定細胞分散在這些液滴之中，一般液滴間距約數(shù)百。振蕩信號頻率由實驗公式（）確定：（）其中是液流速度，為噴孔直徑。根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明細胞是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉，落入收集器中，充電電壓一般選或，偏轉板間的電位差為數(shù)千伏。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，可根據(jù)具體要

15、求進行適當調整。圖為傳統(tǒng)流式細胞儀的細胞分選過程。尊，酗傳統(tǒng)流式細胞儀分選過利流式細胞儀的應用流式細胞術相對于其它細胞分析技術，具有以個優(yōu)點：）高分析速度，每秒可檢測分析個細胞。）高分選速度，精度可達以上。）高熒光靈敏度，能夠區(qū)分僅有差別的兩個細胞。）多參數(shù)檢測。因此，基于流式細胞術的流式細胞儀在細胞生物學，免疫學，腫瘤學等方面有著極其廣泛的應用。，和細胞周期的分析隨著流式細胞儀在臨床腫瘤病中的應用，測定細胞含量的異常增加，對于腫瘤的診斷具有結論性的意義。腫瘤細胞有其特定的細胞周期，利用流式細胞儀測定細胞周期內各個時期的動力學參數(shù)，借以揭示腫瘤細胞的生物學特點，作為指導腫瘤治療、病癥發(fā)展過程、

16、預后等的參數(shù)。人體正常的體細胞應該有比較穩(wěn)定的二倍體含量，但細胞發(fā)生癌變的過程中，細胞的含量會發(fā)生異常改變，出現(xiàn)非整倍體。流式細胞儀能夠測出含量的改變，然后將細胞群體的各個熒光強度繪制成圖，從而顯示細胞的相對含量。測量的含量可用于血液中的網(wǎng)織紅細胞的檢測和計數(shù)。網(wǎng)織紅細胞是從骨髓最新釋放到外周血的成熟紅細胞的前體，它的數(shù)目是反映紅細胞造血功能的重要指標。淋巴細胞亞群分析淋巴細胞具有表面特異性抗原差異，這些不同抗原表現(xiàn)型的亞群執(zhí)行不同的機能，當亞群之間的比例失調時，人體已經(jīng)受到疾病的侵害。在流式細胞儀上結合免疫熒光方法，可以辨別和計數(shù)帶有不同表面特異性抗原的淋巴細胞，對于機體的細胞免疫狀況提供了

17、依據(jù)。通過檢查血液中的含量，可以檢測艾滋病。艾滋病是一種由人類淋巴細胞病毒（）感染而造成的疾病，該病毒主要侵襲淋巴細胞，在臨床上表現(xiàn)為，外周血中細胞減少，并且在淋巴細胞中所占的比例下降。細胞受體的分析受體研究是當代醫(yī)學研究的熱點，因為許多生物的活性物質需要通過細胞受體起作用。通過對細胞表面受體（如轉鐵蛋白受體、低密度脂類受體、淋巴因子受體等）進行定性定量分析，有助于對許多疾病進行確診，如腫瘤、冠心病、內分泌疾病等。其它方面應用流式細胞儀的其它應用還包括：診斷和治療白血??；研究和診斷獲得性或先天性缺陷?。谎褐写竽c桿菌等。微流控芯片流式細胞分析系統(tǒng)的研究進展傳統(tǒng)的流式細胞儀雖已實現(xiàn)商品化，但仍存

18、在儀器體積大、結構復雜、造價高等局限性，所以對流式細胞儀改進已迫在眉睫。微流控芯片所具有的特點，使其最有可能應用到流式細胞分析，從而降低成本和體積。具體包括：微流控芯片上岬級的通道結構與生物細胞尺度上相容。微流控芯片網(wǎng)絡式二維或三維通道結構較易實現(xiàn)單個細胞進樣與控制。微流控芯片微通道中利用流體動力、氣壓、重力、電壓等多種手段，可以簡化單細胞計數(shù)、篩選、胞內分析等過程。微流控芯片微加工技術，可以將多個部件和功能集成到同一個芯片上，較易制成功能齊全的便攜式儀器。因此，微流控芯片用于流式細胞分析是近年來該技術發(fā)展的熱點之一，自等【】首次建立微流控流式細胞儀以來，國內外研究者不斷將光散射法，熒光標記法

19、，阻抗變化等方法應用到芯片流式細胞分析中。基于微流控芯片的流式計數(shù)方法庫爾特技術庫爾特（）技術通過測量電阻變化進行微粒計數(shù)，當細胞通過小孔引起電阻的變化時，電路電流中將會產(chǎn)生一個脈沖，脈沖越大，表示通過的細胞體積越大，就可以對細胞進行計數(shù)和分選。年，等【】研制出了一套基于微流控芯片的庫爾特粒子計數(shù)器。如圖所示，該裝置中有股溶液，最中間為樣品液，靠近樣品液的股液體為電解液，可以起到鞘流作用；最外層的股液體為非電解液，具有動態(tài)調節(jié)鞘流有效寬度的能力。樣品液中的微粒在股電解液的作用下逐個通過中間狹小的區(qū)域，從而引起出口處電阻的變化。：曲：健：，圖微流控芯片庫爾特計數(shù)器¨年，等在庫爾特計數(shù)技

20、術基礎上，利用正弦交流阻抗方法，發(fā)展了一個微流控芯片細胞計數(shù)裝置。檢測細胞頻率達，能區(qū)分微粒的體積。圖是模擬微流控芯片通道中細胞流動造成電阻變化，為三個電極，之間的電阻與之間的電阻差值，即為細胞的電阻。該儀器還處于初步測試階段，還有許多部分需要進一步完善。圖幣微流控芯片細胞計數(shù)器浙江人學頤學位論文第一章微流拄流式細胞儀的研究年，等將阻抗變化的檢測進一步應用到細胞計數(shù)。如圖所示，微流控芯片通道內集成了聚合電解質鹽橋電極，可以檢測流經(jīng)細胞的電阻變化，從而完成細胞計數(shù)，且能辨別細胞的體積。圖基于聚合電解質鹽橋的流式細胞分析系統(tǒng)“?！啊！敝?。：蘭：；：”。“。”咖“”“。“”一檢測細胞光散射和熒光技

21、術利用光散射法和熒光標記法檢測微?；蚣毎橇魇郊毎嫈?shù)最常用的技術。將熒光染色的細胞排成單列通過微通道，用激光照射通過的單細胞，將發(fā)出的瞬間散射光和熒光轉換成電信號，最后用計算機進行處理，進行細胞的計數(shù)和分選。年，等報道了一種基于簡單微流控十字通道芯片的流式細胞分析系統(tǒng)。如圖所示，系統(tǒng)中使用的氳離子激光器，以電滲流方法對細胞或熒光微球進行鞘流驅動，當細胞或熒光微球通過檢測區(qū)時，發(fā)出的散射光和熒光，都由同一個目鏡接收，再使用二向色鏡將散射光和熒光分開，分別由不同的光電倍增管檢測。如圖所示。撕等”在微流控蕊片通道內覆蓋一層聚基硅氧烷（），防止細胞貼壁，如圖一所示，在電滲流作用下，對細胞進行散射光

22、和熒光檢測。撕學明學論空第一微“。擰：式胞住的研究圖簡單十字芯片的鞘流圈自】圖用于細胞計數(shù)的微流控芯片等”研制了一套檢測細胞內片段的流式細胞分析儀（圖）。實驗中分別使用綠光激發(fā)的一和紅光激發(fā)的染細胞，在各自的激光激發(fā)下，細胞發(fā)出的熒光由不同的雪崩二極管接收。由染色的細胞得到的熒光信號強度，可以反映出整個細胞的長度；染色的細胞熒光信號能夠反映特殊的長度。儀器的靈敏度可達到單分子水平，對單個分子的信噪比為。圖檢測片段的流式細胞儀一“”浙人學硎學位論文第章馓控¨：“式女胞儀的宄等【“對基于微流控芯片的多角度散射光進行了研究。該儀器在。和。兩個方向上檢測散射光，利用這兩個散射光的信號，可以進

23、行微粒的計數(shù)和體積大小的分辨。如圖所示，微粒在真空泵和夾流液的作用下，逛個通過激光斑點處，發(fā)出散射光信號，并使用光電倍增管在。和。方向檢測散射光，用于進一步的分析。該研究組不僅將該儀器應用到熒光微球的計數(shù)和體積大小的分析，而且還應用于反應蛋白含量的分析，用于急性炎癥、組織損傷、心肌梗塞、心臟病等疾病的研究。圖（）儀器結構圖（）儀器實際照片（）等【”提出了一套集成化的流式細胞計數(shù)裝置，在芯片通道處植入光纖接收細胞散射信號。圖所示，計算機控制的注射泵調整鞘流流速，使得細胞通過激光聚焦點，由雪崩二極管接收散射光信號，最后可以測定不同細胞的體積。年該研究組”報道了基于微流控技術的流式細胞儀，該儀器集細

24、胞計數(shù)和分選功能于一體，如圖所示。在芯片上實現(xiàn)了細胞兩層鞘流結構，增強了細胞計數(shù)能力。細胞通過各自鞘流區(qū)的檢測點時，由高分辨率的攝像機采浙大學順學位論文第帝融流擋芯片：洫武日儀究集信號。陔研究組進行了細胞訓數(shù)，井計算了細胞在各自鞘流通道中的速度。見外，在芯片下游通道內安胃了乜極，利用電撒產(chǎn)。的負介電電泳作用，對血細胞進行分選。幽微流控芯片流式細胞計數(shù)裝置糞。壓渴妒聲等忑三引；！巨；巨訇叵習一二苫二酗流式細胞儀兩層鞘流結構圖卸浙學碰岸位論文第一章徽拉”：流式自¨胞儀的研究年，￥¨成功地研制出了高效且不損害細胞的流式細胞分析儀，可對較少量珍貴細胞進行分析。如圖所示，泵位于計算機

25、控制的盲文顯示器處，能夠精確調整液體流速。采用芯片，并在微通道處增加擴散裝置，以減小泵產(chǎn)生的影響。樣品液池為夾角為。的圓錐形結構，位于泵的前面，可以減小使用過程中對細胞的機械損害。采用熒光微球檢測儀器的分析性能，分析了經(jīng)探針染色的細胞周期，并進行了細胞計數(shù)，速度為塒。圉芯片二維通道結構也”艾滋病是人類近代醫(yī)學史上最引起人們關注和最使人恐懼的一種疾病，世界衛(wèi)生組織將每年的月日定為世界艾滋病日。在發(fā)展中國家，已經(jīng)有萬人感染了艾滋病，每天有個新的感染者，各個國家都在采取有效措施降低感染率。采用高效、簡便、低廉的方法檢測病毒，已是一個迫切需要解決的問題。等【“利用色譜法進行早期測試。在微流控芯片通道內

26、固定上單克隆抗體，當血液流到通道內，淋巴細胞和單核細胞固定在通道表面，通過加入不同的染料區(qū)別這兩種細胞，在倒置顯微鏡下顯示綠色熒光的為淋巴浙學頓±學論文第一章微流控芯片流式日胞位的研究細胞，從而得到淋巴細胞數(shù)目，如圖所示。這個儀器的優(yōu)點是，直接測定手指處的血液，不用進行預處理；但是該儀器不能進行大量細胞的分析。衛(wèi)毛圖計數(shù)儀瑚等提出了一種新型的技術，即在芯片上檢測淋巴細胞的數(shù)目和百分率。該儀器使用金屬氧化物半導體場效應晶體管檢測細胞的數(shù)目，淋巴細胞經(jīng)過檢測區(qū)時引起電路中電壓的變化，從而導致儀器中漏電流信號變化，產(chǎn)生信號脈沖，并且脈沖的高度與細胞的體積成正比：用光電倍增管收集熒光信號。實

27、驗裝置如圖卜。利用該儀器檢測到的淋巴細胞數(shù)目以及百分率，與傳統(tǒng)流式細胞儀檢測到的結果相似。該儀器的缺點是檢測速度較慢，為心浙江大學碩士學位論文第一章微流控芯片上流式細胞儀的研究圖實驗裝置圖微流控流式細胞儀中單細胞操作方法目前對單細胞的操控技術有以下幾種，如液壓驅動，聚焦激光捕獲，電滲流操縱，介電電泳捕獲等。利用上述方法，可使細胞進入激光檢測區(qū)，而且多種操控技術可以相結合實現(xiàn)細胞分選。液壓驅動即重力驅動，由于樣品池和廢液池之間存在液位差，并且可以調整液位差，改變細胞流動速度，實現(xiàn)細胞的流動進樣。等【】利用重力作用將細胞夾流進入檢測區(qū)，這種方法可以減小細胞的損失，實驗中采用激光器。如圖所示，檢測到

28、的熒光信號反饋到計算機，然后由計算機控制泵的開關來實現(xiàn)細胞的分選。實驗中利用該儀器對熒光微球和雞血細胞進行分選，分析速度達。隊學塒位論空第十礅托“胞日圈熒光分選系統(tǒng)結構生口年，羅國安等口”研制出了一套熒光分選微流控流式細胞儀（結構如圖）。該儀器是以傳統(tǒng)的共聚焦光路為基礎（圖，）。細胞在重力的作用下，逐個進入檢測區(qū)，利用電滲流進行細胞分選，活性細胞通過檢測區(qū)時，細胞自身的負電，使得活性細胞進入收集通道：非活性細胞發(fā)出的熒光信號，經(jīng)光學系統(tǒng)檢測反饋到電壓控制系統(tǒng)，從而作用于檢測區(qū)的電場停止，非活性細胞進入中間通道，如圖，。為了防止凋亡細胞在玻璃通道上貼壁，實驗中加入了定量的羥丙基甲基纖維素提高了系

29、統(tǒng)的可靠性。第一帝馓流攛”施位帕¨究哆默擻葉“嚀圉（）熒光分選微流控流式細胞儀結構，（）芯片微通道（）：，（）：”利用激光捕獲作用力原理，將光聚焦到細胞上，由于細胞對光有反射、折射和吸收作用，光的動量發(fā)生改變，從而使得細胞獲得了動量，即光對細胞產(chǎn)生了一個作用力，所謂“光壓”。等利用激光捕獲（光鑷）技術對細胞進行了分選，如圖所示。細胞在重力作用下進入熒光檢測區(qū)，用觀測經(jīng)過的細胞。未染色的細胞流入廢液區(qū)，染色的細胞在光鑷作用下被收集，從而實現(xiàn)了細胞的分選。這種方法靈敏度高，但不適用于多種細胞的分選。第章微流檸剮，目吣儀的究圖光鑷流式細胞分選系統(tǒng)，：系統(tǒng)結構示意蹦：芯片分選結構圖盯：電滲流

30、驅動原理，在為中性或堿性的條件下，玻璃通道表面攜帶負電，與通道相鄰的液體部分攜帶正電，從而形成雙電層。在通道兩側施加電壓，帶正電的電層在電場作用下，發(fā)生移動，從而帶動整體液流流動產(chǎn)生電滲流。等口”采用多層軟光刻方法，研制出了集成化的細胞分選器，結構如圖所示。儀器逆分選細胞過程分為三個階段：缺省模式，逆轉模式復原模式。當儀器檢測到所需的細胞時，進入逆轉模式，即改變逆轉泵的頻率，細胞慢慢回到檢測區(qū)，重新檢測，然后關閉所有的轉換閥，通道里的溶液停止流動，開啟分析閩，細胞進入分選通道，完成細胞分選。該儀器具有以下優(yōu)點；對細胞損害小，儀器價格便宜，易操縱，缺點：通量低。浙江大學碩士學位論文第一章微流控芯

31、片上流式細胞儀的研究圖集成化細胞分選儀結構圖介電電泳作用是，細胞在非均勻的交流電場中被極化，產(chǎn)生偶極距而在電場中移動，若細胞電泳方向和其它作用力（如重力）方向相反，可以靜止在任何位置【。由于細胞介電特性、導電率、體積大小不同等，細胞產(chǎn)生的偶極距也不一樣【，當細胞的極性程度高于溶液時，介電電泳力隨著電場尺度增加，稱為正介電電泳；反之為負介電電泳【翻。等【刎介紹了一種能自動分選細胞和細胞核的芯片，該芯片集成了微泵微閥，利用介電電泳作用實現(xiàn)了細胞的分選（如圖）。集成芯片大小為。實驗中，對具有活性和非活性的細胞進行了分選，如圖所示，在正介電電泳的作用下，活性細胞吸附到微電極表面，非活性細胞被分選到非活

32、性細胞槽中，等到非活性細胞分選完成后，停止供給介電電泳的電壓，活性細胞被釋放，微泵開始作用，活性細胞分選到另一個通道中。另外，可以在通道中加入破膜劑，使用上面的方法，實現(xiàn)細胞核的分選。該芯片可以實現(xiàn)個細胞樣品的分選。浙江大學碩上學位論文第一章微流控芯片上流式細胞儀的研究一一、匹，翌。毒淞伽涵它菇尹、圖集成化芯片結構圖一一弓。一：李匹巴一一圖介電電泳作用示意圖等】利用介電電泳開關把細胞分選到五個通道中，進一步實現(xiàn)了分選系統(tǒng)的多通道化。在芯片側壁處放置十字交叉電極，產(chǎn)生非均勻的交流電場，使得細胞或微球等微粒受到負介電電泳力而移動。如圖所示，該儀器將微粒分選到不同通道，實驗過程中，省略了常用的微粒夾

33、流過程，只需改變兩側電極的電壓，微粒在通道中受力發(fā)生了變化，微粒的流動方向也發(fā)生了變化，從而實現(xiàn)了細胞的分選。￥論弟章觸拄：胞倥的究。徭至翟瞠籃睡髓群！、，。瞄，圈基矗二！二：圖介電電泳細胞分選過程吼小型微流控流式細胞儀的發(fā)展隨著微流控芯片上的流式細胞分析研究的不斷深入國內外的研究組開始研制集成化的微流控芯片流式細胞儀這為流式細胞儀的小型化提供了基礎。等口”研制出便攜式的流式細胞分析系統(tǒng)采用一次性的芯片，如圖所示，當細胞流經(jīng)點時，在，兩側鞘流液作用下，逐個通過檢測點，發(fā)出的熒光由雪崩二極管接收并反饋到計算機，當尋找到合適的細胞時，計算機便會自動丌啟和處泵閥，進行細胞分選。幽一單細胞分選芯片上的

34、流體模型一年，等【研制出一套基于微流控：卷片的微型流式細胞儀，將光纖集成到芯片壁上，如圖所示。氦氖激光器發(fā)出的紅色激光，經(jīng)集成在芯片壁上的透鏡聚焦到通道中，微球在激光作用下發(fā)出散射光，檢測光纖在特定的角度處檢測前向散射光和側向散射光，進行微球計數(shù)（圖）。但是該儀器中光損耗太大，不利于進一步小型化。削微“流式細胞儀的結構圖】浙江大學傾學位論第微流掙芯¨漉，胞怔呻究】。¨一一曲一？主謄圖光纖連接部位的通道圖等研制出了基于光波導原理的細胞計數(shù)儀，能夠多角度檢測細胞散射光，該儀器的光波導核心部分是液體通道。如圖所示，激光束從棱鏡處入射到芯片通道內，遇到細胞后發(fā)出散射光。發(fā)出的散射光

35、由半球形透鏡接收，入射到進行檢測。半球形透鏡可以接收來自通道內。的散射光。實驗中，以直徑為和的熒光微球模擬細胞進入芯片通道，檢測側向散射光，得出側向散射光信號與微球的體積成比例，實驗還發(fā)現(xiàn)熒光微球的位置會嚴重影響散射光的發(fā)射模式。圖基于波導細胞計數(shù)儀的原理圖【】第一市礅流控武胞儀的宄年，等通過在芯片上微泵，成功的研制出一臺小型流式細胞儀。如圖所示，芯片入口處的微泵提供細胞鞘流所需的驅動力。出口處的微泵在反饋的熒光信號控制下，可以進行細胞的分選。儀器采用的激光器，能夠減小儀器的體積。該儀器的優(yōu)點是體積小，重量為。缺點是檢測速度慢，僅為；：占片加工過程復雜。卜“？茹“口爭緊一一一”卜曰囡圖芯片的結構示意圖等”利用介電電泳作用，設計一套小型的細胞分析裝置（圖）。該儀器由三部分組成：液體進口處泵管，細胞分離區(qū)，細胞分選通道。細胞分離區(qū)是一個具有獨特形狀，且電場力分布不均勻的區(qū)域，此區(qū)域由一系列微電極控制，細胞在微電極控制的芯片通道中受到不同的介電電泳作用力，從而實現(xiàn)細胞的分離。以酵母細胞為研究對象，在泵的作用下，將酵母細胞和緩沖液按一定比例夾流進入分離區(qū)。活細胞與非活性細胞由于介電特性等的不同，受到不同介電電泳力，細胞偏轉到不同通道，從而實現(xiàn)分選。該儀器通過控制暑曰浙人學碩學位論立第一章微流控芯片漉武細胞