有機(jī)色譜分離技術(shù)

1、有機(jī)色譜分離技術(shù) 色譜法又稱層析法。它是有機(jī)化合物分離、分析的重要方法之一。既可用于分離復(fù)雜的混合物，又可以用來(lái)定性鑒定，尤其適用于少量物質(zhì)的分離和鑒定。這種技術(shù)不僅用于石油、化學(xué)化工等部門，而且在藥物分析、中草藥有效成分的分離分析、藥物體內(nèi)代謝研究、毒物分析及環(huán)境保護(hù)等方面也是必不可少的工具。色譜法與溶劑萃取法相似，也是以相分配原理為依據(jù)。利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附、溶解性能的不同或其它親和作用性能的差異，在混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)時(shí)，通過(guò)反復(fù)的吸附或分配作用，將各組分分開。流動(dòng)的混合物溶液稱為流動(dòng)相；固定的物質(zhì)稱為固定相。如果化合物和固定相的作用較弱，那它將在流動(dòng)相的沖

2、洗下較快地從層析體系中流出來(lái)；反之化合物和固定相的作用較強(qiáng)，它將較慢地從層析體系中流出來(lái)。根據(jù)操作條件的不同，色譜法可分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高效液相色譜等類型。有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的有薄層色譜、柱色譜和紙色譜。應(yīng)用色譜法的目的有兩個(gè)，一是用于分析，二是用于制備分離。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，?shí)際操作中要把握好速度、分離度與分析樣品量的關(guān)系，如果想得到比較純的樣品，那么上樣量就不必太多，樣品量少有利于各組分的分離。色譜法分離混合物時(shí)各組分在固定相表面存在不同的吸附與脫附的平衡，一個(gè)分子的吸附性能與極性有關(guān)，也與吸附劑的活性及流動(dòng)相的極性有關(guān)?；衔锏臉O性很大程度依賴于官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱，因

3、此不同類型的化合物往往表現(xiàn)出不同的吸附能力，常見官能團(tuán)的極性順序如下：飽和烴<烯烴<芳烴、鹵代烴<硫化物<醚類硝基化合物<醛、酮、酯<醇、胺<亞胺<酰胺<羧酸當(dāng)然這一順序只是經(jīng)驗(yàn)值，比較粗略，對(duì)于復(fù)雜化合物的極性只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較。在層析中選用何種吸附劑要視被分離的化合物性質(zhì)而定。理想的吸附劑應(yīng)該具備以下條件：能夠可逆地吸附待層析的物質(zhì)；不能使被吸附物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化；粒度大小應(yīng)使展開劑以均勻的流速通過(guò)。硅膠是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣的吸附劑，吸附作用也較強(qiáng)，可用于多種有機(jī)物的分離，市場(chǎng)上有各種不同孔徑大小的硅膠供應(yīng)。由于它略帶酸性（能與強(qiáng)堿性有機(jī)物發(fā)生

4、作用），所以適用于極性較大的酸性和中性化合物的分離。纖維素和淀粉的吸附活性最小，因而多用于分離多官能團(tuán)的天然產(chǎn)物。氧化鋁也是一個(gè)用途很廣的吸附劑，吸附能力強(qiáng)，而且有酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁的pH接近于4，可用于分離氨基酸和羧酸，堿性氧化鋁的pH在10左右，用于分離胺類化合物，中性氧化鋁pH在7左右，用于分離中性有機(jī)物。影響色譜分離度的另一個(gè)重要因素是洗脫劑，洗脫劑的選擇主要根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來(lái)考慮。溶劑的極性越大，對(duì)特定化合物的洗脫能力也越大。色譜用的展開劑絕大多數(shù)是有機(jī)溶劑，各種溶劑極性順序如下： 己烷和石油醚環(huán)己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷 氯仿

5、乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸 其中四氯化碳、苯、氯仿、甲醇等有一定毒性，應(yīng)減少使用。這些溶劑可以單獨(dú)使用，也可以組成混合溶劑使用，特殊情況下還可以先后采用不同極性的溶劑實(shí)現(xiàn)梯度淋洗。1薄層色譜薄層色譜（Thin Layer Chromatography）常用TLC表示，是一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾十微克）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500 mg的樣品。因此又可用來(lái)精制樣品。它是將固定相均勻地涂在薄板（如玻璃板）上，依靠毛細(xì)作用力或重力，使流動(dòng)相通過(guò)固定相的一種色譜。該法設(shè)備簡(jiǎn)單、

6、快速簡(jiǎn)便、選擇性強(qiáng)。它不僅適用于有機(jī)物的鑒定、純度的檢驗(yàn)、定量分離和反應(yīng)過(guò)程的監(jiān)控，而且還常用于柱層析的先導(dǎo)，即在大量分離之前，先用薄層色譜進(jìn)行探索，初步了解混合物的組成情況，尋找適宜的分離條件。在柱層析之后，還可用薄層色譜鑒定洗脫液中的組分。薄層色譜的簡(jiǎn)單操作如下：在洗滌干凈的玻璃板上均勻地涂一層吸附劑或支持劑，待干燥、活化后，將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管點(diǎn)加于薄層板一端，晾干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，待展開劑前沿接近頂端時(shí)，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。記錄原點(diǎn)至樣品點(diǎn)中心及展開劑前沿的距離，計(jì)算比移值（Rf）： 因?yàn)橥晃镔|(zhì)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下才具有相同的Rf值

7、，所以在利用薄層色譜分離與鑒定各種化合物時(shí)，為了得到重復(fù)和較可靠的結(jié)果，必須嚴(yán)格控制條件，如吸附劑和展開劑的種類、層析溫度等；在測(cè)定時(shí)，最好用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照。 薄層色譜最常用的吸附劑是氧化鋁和硅膠。硅膠是無(wú)定形多孔性物質(zhì)，略具酸性，適用于酸性物質(zhì)的分離和分析。薄層色譜用的硅膠分為多種類型，如硅膠H為不含粘合劑的硅膠，硅膠G為含煅石膏粘合劑的硅膠，硅膠HF254含熒光物質(zhì)的硅膠，可于波長(zhǎng) 254 nm紫外光下觀察熒光，硅膠 GF254為既含煅石膏又含熒光劑的的硅膠。氧化鋁可根據(jù)所含粘合劑或熒光劑而分為氧化鋁 G、氧化鋁 GF254及氧化鋁 HF254等。粘合劑除熟石膏（2CaSO4·

8、H2O）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。通常將薄層板按加粘合劑和不加粘合劑分為兩種，加粘合劑的薄層板稱為硬板，不加粘合劑的稱為軟板。薄層色譜還可使用腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等。在紫外光下觀察含有熒光劑的薄層板，展開后的有機(jī)化合物在亮的熒光背景上呈暗色斑點(diǎn)。另外也可將幾粒碘置于密閉容器中，待容器充滿碘的蒸氣后將展開后的色譜板放入，碘與展開后的有機(jī)化合物可逆地結(jié)合，在幾秒鐘內(nèi)化合物斑點(diǎn)的位置呈黃棕色。用碘顯色時(shí)一定要晾干溶劑，因?yàn)榈庹魵饽芘c溶劑分子結(jié)合，如果不晾干就會(huì)掩蓋樣品點(diǎn)的顏色。 2柱色譜 柱色譜法又稱柱上層析法，簡(jiǎn)稱柱層析。它是提純少量物質(zhì)的有效方法。常見的有吸附色譜、分配

9、色譜和離子交換色譜。吸附色譜常用氧化鋁和硅膠為吸附劑，填裝在柱中的吸附劑把混合物中各組分先從溶液中吸附到其表面上，而后用溶劑洗脫。溶劑流經(jīng)吸附劑時(shí)發(fā)生無(wú)數(shù)次吸附和脫附的過(guò)程，由于各組分被吸附的程度不同，吸附強(qiáng)的組分移動(dòng)的慢留在柱的上端，吸附弱的組分移動(dòng)的快在下端，從而達(dá)到分離的目的。分配色譜與液液連續(xù)萃取法相似，它是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的液相間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離，常以硅膠、硅藻土和纖維素作為載體，以吸附的液體作為固定相。離子交換色譜是基于溶液中的離子與離子交換樹脂表面的離子之間的相互作用，使有機(jī)酸、堿或鹽類得到分離。（1）吸附劑的選擇 理想的吸附劑應(yīng)該具備以下條件：能夠可逆地

10、吸附待分離的物質(zhì)；不能使被吸附物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化；粒度大小應(yīng)使展開劑以均勻的流速通過(guò)色譜柱。硅膠是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣的吸附劑，市場(chǎng)上有各種不同孔徑大小的硅膠供應(yīng)。由于它略帶酸性，能與強(qiáng)堿性有機(jī)物發(fā)生作用，所以適用于極性較大的酸性和中性化合物的分離。吸附劑的用量與待分離樣品的性質(zhì)和吸附劑的極性有關(guān)。通常吸附劑用量為樣品量的3050倍，如樣品中各組分性質(zhì)相似，則用量應(yīng)更大。（2）溶劑和洗脫劑的選擇一般把用以溶解樣品的液體稱為溶劑，而用來(lái)洗色譜柱的液體叫做洗脫劑或淋洗液，兩者常為同一物質(zhì)。在選擇時(shí)可根據(jù)樣品中各組分的極性、溶解度和吸附劑的活性等來(lái)考慮，且經(jīng)常要憑經(jīng)驗(yàn)決定。洗脫劑的極性大小對(duì)混合物的分離影響

11、較大。極性越大，洗脫能力或展開能力越強(qiáng)，化合物移動(dòng)就越遠(yuǎn)。因此，所用的洗脫劑應(yīng)從極性小的開始，以后逐漸增加極性。也可以使用混合溶劑，其極性介于單一溶劑極性之間，并采取逐步增加極性較大溶劑的比例，使吸附強(qiáng)的組分洗脫下來(lái)。有時(shí)還可以采用梯度淋洗法，即在洗脫過(guò)程中，連續(xù)改變洗脫劑的組成，使溶劑極性逐漸增加，這樣洗脫可使樣品中的組分在較短時(shí)間內(nèi)分離完畢。（3）色譜柱的裝填 色譜柱一般用透明的玻璃做成，便于觀察實(shí)驗(yàn)情況。底部的玻璃活塞應(yīng)盡量不涂油脂，以免污染洗脫液。柱子大小視處理量而定，通常柱的直徑與高度之比為 110 170。先將色譜柱垂直地固定于支架上，柱的下端鋪一層脫脂棉（或玻璃棉）。為了保持平整

12、的表面，可在脫脂棉上再鋪一層約5 mm厚的石英砂，有的色譜柱下端已是用砂心片燒結(jié)而成，可直接裝柱。干法裝柱：在柱的上端放一玻璃漏斗，使吸附劑經(jīng)漏斗成一細(xì)流，慢慢注入柱中，并經(jīng)常用橡皮錘或大橡皮塞輕輕敲擊管壁，使填裝均勻，直到吸附劑的高度約為柱長(zhǎng)的四分之三為止。然后沿管壁慢慢地倒入洗脫劑，使吸附劑全部潤(rùn)濕，并略有多余。最后在吸附劑頂部蓋一層約5 mm厚的石英砂。由于這種方法在添加溶劑時(shí)易出現(xiàn)氣泡，吸附劑也可能發(fā)生溶脹，所以一般很少采用。為了克服上述缺點(diǎn)，通常先將洗脫劑加入柱內(nèi)，約為柱高的四分之三處，然后一邊通過(guò)活塞使洗脫劑緩緩流出，一邊將吸附劑通過(guò)玻璃漏斗慢慢地加入，同時(shí)用橡皮錘輕輕敲擊柱身，待

13、完全沉降后，再鋪上沙子或用小的圓濾紙覆蓋，以防加入樣品或洗脫劑沖動(dòng)吸附劑表面。濕法裝柱：將洗脫劑裝入約為柱高的二分之一后，把下端的活塞打開，使洗脫劑一滴一滴地流出，然后通過(guò)玻璃漏斗將調(diào)好的吸附劑和洗脫劑的糊狀物，慢慢地倒入柱內(nèi)。加完后繼續(xù)讓洗脫劑流出，直到吸附劑完全沉降，高度不變?yōu)橹?，最后再加入石英砂或一張圓濾紙。這種方法比干法好，因?yàn)樗砂蚜粼谖絼﹥?nèi)的空氣全部趕出，使吸附劑均勻地填在柱內(nèi)。（4）加樣與洗脫 柱填裝后，讓洗脫劑繼續(xù)流出，到液面剛好接近吸附劑表面時(shí)關(guān)閉活塞。將樣品溶于少量洗脫劑中，小心地沿柱壁加入柱中，形成均勻的薄層，打開活塞，直到液面接近吸附劑表面時(shí)再關(guān)閉活塞。用少量洗脫劑洗

14、滌柱壁上的樣品，重新打開活塞使液面下降至吸附劑表面。重復(fù)3次，使樣品全部進(jìn)入吸附劑，然后用洗脫劑洗脫。洗脫速度不宜過(guò)快，以每秒 12滴為宜，否則柱中交換來(lái)不及達(dá)到平衡會(huì)影響分離效果。操作過(guò)程中要及時(shí)添加洗脫劑，不要讓洗脫劑走干，否則易產(chǎn)生氣泡或裂縫，影響分離效果。收集的洗脫液一般520 mL為一瓶，具體的量要視情況而定。所得洗脫液可用薄層色譜或紙色譜跟蹤，并決定能否合并在一起。對(duì)有色物質(zhì)，也可按色帶分別收集。無(wú)色的樣品如經(jīng)紫外光照射能呈熒光的，可用紫外光照射來(lái)觀察和監(jiān)測(cè)混合物展開和洗脫的情況。洗脫液合并后，蒸去溶劑就可以得到某一組分。如果是幾個(gè)組分的混合物，需用新的色譜柱或通過(guò)其它方法進(jìn)一步分

15、離。3紙色譜 紙色譜法又稱紙上層析法，其實(shí)驗(yàn)技術(shù)與薄層色譜有些相似，但分離的原理更接近于萃取。在紙色譜中，濾紙是載體，不是固定相，濾紙上的水才是固定相（纖維素能吸收高達(dá)22的水），展開劑為流動(dòng)相。當(dāng)色譜展開時(shí)，溶劑受毛細(xì)作用，沿濾紙上升經(jīng)過(guò)點(diǎn)樣處，樣品中各組分在兩相中不斷進(jìn)行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，結(jié)果在流動(dòng)相中具有較大溶解度的組分移動(dòng)速度較快，而在水中溶解度較大的組分移動(dòng)速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。因此，紙色譜法也稱為紙上分配色譜。與薄層色譜一樣，紙色譜也用于有機(jī)物的分離、鑒定和定量測(cè)定。它特別適用于多官能團(tuán)或極性大的化合物的分析，例如碳水化合物、氨基酸和天然色素等，只要紙的質(zhì)量、展

16、開劑和溫度等條件相同，比移值（Rf值）對(duì)于每種化合物都是一個(gè)特定的值，可作為各組分的定性指標(biāo)。實(shí)際上，由于影響比移值的因素很多，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)記載的不完全相同，因此在測(cè)定時(shí)要與標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照才能斷定是否為同一物質(zhì)。紙色譜的缺點(diǎn)是溶劑的展開所需的時(shí)間長(zhǎng)，操作不如薄層色譜方便。（1）濾紙的選擇 選擇的濾紙應(yīng)厚薄均勻、平整無(wú)折痕，通常用新華1號(hào)濾紙。濾紙大小可自行選擇，一般長(zhǎng)2030 cm，寬度以樣品個(gè)數(shù)多少而定。操作時(shí)手指不能與濾紙的層析部分接觸，否則指印將和斑點(diǎn)一起顯出。（2）展開劑的選擇 要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，選用合適的展開劑。水是作為展開劑的一個(gè)組分，因此所有展開劑通常需先用水飽和，以使溶劑在濾紙上移動(dòng)時(shí)有足