佛甲草對小鼠實驗性肝損傷的保護(hù)作用(一)

1、佛甲草對小鼠實驗性肝損傷的保護(hù)作用(一)    作者：周青 劉建新 周俐 熊小琴 趙海燕【關(guān)鍵詞】 ,佛甲草；,實驗性肝損傷；,保護(hù)作用；,脂質(zhì)過氧化摘要：目的:觀察佛甲草對小鼠實驗性肝損傷的保護(hù)作用。方法:分別采用四氯化碳（CCl4）、萘異硫氰酸酯（ANIT）一次性灌胃中毒致小鼠急性肝損傷及黃疸模型，測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBiL）含量及血清、肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）水平和觀察肝組織病理變化，分析佛甲草對上述指標(biāo)的影響。結(jié)果:佛甲草能明顯降低CCl4中毒性小鼠血清ALT、血清及肝組織中MDA

2、含量（P0.01）,使SOD，NO水平顯著增高（P0.01，P0.001）; 能明顯降低ANIT中毒性小鼠血清TBil含量(P0.001); 肝臟病理組織學(xué)檢查表明佛甲草能明顯減輕肝細(xì)胞的變性和壞死。結(jié)論: 佛甲草對CCl4和ANIT所致的急性肝損傷有保護(hù)作用, 其機(jī)理可能與抗脂質(zhì)過氧化及改善肝臟微循環(huán), 恢復(fù)肝臟功能的作用有關(guān)。關(guān)鍵詞： 佛甲草； 實驗性肝損傷； 保護(hù)作用； 脂質(zhì)過氧化Protective Effects of Sedum Lineare Thunb on Experimental Acute Hepatic Injury in Mice Abstract：Objective

3、:To observe the protective effects of solution isolated from sedum lineare thunb on experimental acute hepatic liver injury in mice. Methods:To observe the contents of total bilirubin and alanine aminotransferase (ALT)in serum ,the contents of malondialdehyde(MDA) , activity of superoxide dismutase

4、(SOD) , level of nitrogen monoxide in serum and liver tissue ,hepato-pathohistologic changes by CCl4,naphthalin fluorescein isothiocyanate(ANIT) inducing acute liver injury and icterus respectively in mice by po, the effects of sedum lineare thunb on the biochemical changes were analysed. Results:Th

5、e results showed the extract of sedum lineare thunb could significantly decrease the contents of ALT in serum and the contents of MDA in serum and liver tissue respectively in CCl4 toxicomice（P0.01）, increase the activity of SOD and the level of NO in serum and liver tissue respectively（P0.01，P0.001

6、）;the extract could markedly reduce the contents of TBil in serum in ANIT toxicomice(P0.001). The result of hepatopathohistologic examination showed the extract effectively decreased degeneration and necrosis of liver cells. Conclusion:The extract of sedum lineare thunb has the protective effects on

7、 acute liver injury in mice induced by CCl4 and ANIT.The mechanism is likely related to its ameliorating microcirculation and anti-lipid peroxidation.Key words：Sedum lineare thunb; Experimental hepatic injury; Protective effect; Lipid peroxidation佛甲草（sedum lineare Thunb）為景天科植物佛甲草的全草，性味甘寒，具有清熱、解毒、消腫等

8、功效，民間用于治療黃疸、遷延性肝炎、咽喉腫痛、痢疾等癥1。有關(guān)佛甲草對小鼠實驗性肝損傷的保護(hù)作用目前尚未見報道，故而進(jìn)行了初步研究并探討其機(jī)理。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 佛甲草提取液的制備 佛甲草采自贛州,夏天采集，曬干后粉碎成粗粉，取適量蒸餾水加熱提取2次,30 min/次,過濾,合并2次濾液并濃縮至適量,加入相當(dāng)濃縮液3倍量的95%乙醇,放置冰箱48 h后減壓過濾,濾液回收乙醇至無醇味,用蒸餾水調(diào)整至含4 g/ml的生藥液。1.1.2 試劑 四氯化碳,分析純，上海長江化工廠； 萘異硫氰酸酯；化學(xué)純；北京通縣育才精細(xì)化工廠；谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒,衛(wèi)生部上海生物制品研究所；總膽紅素試劑

9、盒，四川邁克科技有限公司；丙二醛、超氧化物歧化酶、一氧化氮試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。1.1.3 動物 昆明種小鼠，體重(20±2)g，雌雄兼用，贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.1.4 儀器 400型全自動生化儀，日本奧林巴斯公司；721型分光光度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司。1.2 實驗方法1.2.1 急性毒性實驗健康昆明種小鼠50只，均衡隨機(jī)分為5組，每組10只。按急性毒性實驗方法2設(shè)計藥物劑量的組間距為10.9。一次性ip0.2 ml/10g佛甲草提取液后,觀察小鼠運(yùn)動、呼吸、皮毛反應(yīng)、進(jìn)食等情況并記錄3 d內(nèi)死亡數(shù)。1.2.2 CCl4造模與檢測48只昆明種小鼠，每組

10、12只，隨機(jī)分成4組，分別為對照組，CCl4模型組，治療組，治療組。對照組和模型組分別灌胃生理鹽水10 ml/kg；治療組小鼠灌胃佛甲草提取液4 g/kg；治療組灌胃佛甲草提取液5 g/kg。1次/d，連續(xù)15 d。末次給藥后2 h，正常組腹腔注射等容量花生油，其余各組均腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液10 ml/kg一次。禁食，自由飲水。16 h后各組小鼠斷頭取血。以12 000 r/min離心5min，取血清，采用400型全自動生化分析儀測定ALT活性；采用分光光度法測定MDA，SOD，NO穩(wěn)定終產(chǎn)物硝酸鹽/亞硝酸鹽水平（NO3/NO2）。MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸法，SOD活力測

11、定采用黃嘌呤氧化酶法， NO測定采用硝酸還原酶法。取適量肝組織用冰冷生理鹽水沖洗，置冰浴中勻化制得10%肝勻漿，以3 500 r/min離心10min，取上清液測定MDA，SOD，NO3/NO2水平，蛋白定量采用考馬斯亮蘭法,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。具體步驟均按各試劑盒說明書操作。另取各鼠相同部位的肝臟用10%福爾馬林溶液固定，采用常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞變性壞死程度。分級標(biāo)準(zhǔn)：在1個肝小葉中，（+）表示只有幾個細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的病理改變，分布散在；（+）表示50%左右細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的病理改變，分布較廣；（+）表示絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的病理改變，分布彌散；（）表示未發(fā)生相應(yīng)的病理改變。

12、1.2.3 ANIT造模與檢測昆明種小鼠60只，每組15只，分組及用藥處理同前。除正常組外，其余各組分別于第13天給藥后2 h 灌胃ANIT花生油溶液60 mg/kg一次。所有小鼠在ANIT中毒前和處死前分別禁食18 h，自由飲水。ANIT中毒48h后斷頭取血。離心，取血清，采用400型全自動生化分析儀測定TBil含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。1.2.4 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)以 ±s表示，采用雙側(cè)t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計處理。2 結(jié)果 2.1 佛甲草提取液對小鼠的急性毒性實驗 結(jié)果見表1。由表1可見，最高劑量組（25.74 g/kg）小鼠ip給藥后不久即活動增加、興奮燥動、呼吸急促、驚厥，最后相

13、繼全部死亡；最低劑量組（16.89 g/kg）小鼠活動、呼吸、進(jìn)食等均正常，全部存活。 2.2 佛甲草提取液對CCl4肝損傷小鼠肝臟組織學(xué)的影響表2可知，與正常組相比，模型組出現(xiàn)以肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤為特點的急性肝損傷表現(xiàn)；與模型組相比，治療、組病變明顯減輕。提示佛甲草提取液對CCl4中毒所致小鼠肝細(xì)胞損傷有明顯保護(hù)作用。2.3 佛甲草提取液對CCl4，ANIT中毒小鼠血清ALT，TBil 含量的影響表3可見，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT，TBil含量顯著增高（P0.001）；治療，組小鼠血清ALT，TBil含量均明顯低于模型組（P0.01，P0.0）。提示佛甲草提取液能

14、明顯降低CCl4，ANIT中毒小鼠血清ALT，TBil含量。表1 佛甲草提取液對小鼠急性毒性的影響（略）用寇氏法計數(shù)算出LD50為21.5±0.001 75 g/kg表2 佛甲草提取液對CCl4肝損傷小鼠肝臟組織學(xué)的影響（略）表3 佛甲草提取液對CCl4、ANIT中毒小鼠血清ALTTBil 含量的影響（略）與正常組比較，a P0.01；與模型組比較， b P0.001，c P0.01，d P0.05表4 佛甲草提取液對CCl4中毒小鼠血清、肝組織MDA、SOD、NO3/NO2水平的影響（略）與正常組比較，a P0.01；與模型組比較，b P0.001，cP0.01，dP0.05；n=

15、12 2.4 佛甲草提取液對CCl4中毒小鼠血清、肝組織MDA，SOD，NO3/NO2水平的影響結(jié)果見表4。與正常組比較，模型組小鼠血清、肝組織MDA含量顯著升高，SOD，NO3/NO2水平顯著降低（P0.001，P0.01）；治療、組小鼠血清、肝組織MDA含量均明顯低于模型組（P0.01，P0.05），SOD，NO3/NO2水平明顯高于模型組（P0.001，P0.01，P0.05）。提示佛甲草提取液對CCl4中毒小鼠血清、肝組織MDA含量具有顯著的抑制作用，對SOD，NO3/NO2水平具有顯著的提高作用。3 討論肝臟是外源性過氧化物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化與排泄的主要場所，肝內(nèi)經(jīng)氧化還原后產(chǎn)生多種自由基，

16、后者可引起組織過氧化損傷。近年來，對有毒基團(tuán)在肝損傷中的作用十分重視，據(jù)文獻(xiàn)報道，有毒氧基在肝細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要作用3。氧自由基主要通過脂質(zhì)過氧化損傷肝細(xì)胞。CCl4是一種常用的肝毒劑，用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷，其致毒機(jī)理4是CCl4經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝生成自由基（?CCl3），攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化，或與肝微粒體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，蛋白合成障礙，甘油三脂蓄積，胞漿中可溶性酶如ALT溶入血中使ALT升高，造成肝細(xì)胞嚴(yán)重空泡變性、嗜酸性變、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤。血清、肝臟脂質(zhì)過氧化的程度可通過測定脂質(zhì)過氧化物等來評價。MDA是不飽和

17、脂肪酸過氧化作用的終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，它在血清及組織中的含量，間接反映了自由基反應(yīng)時組織的破壞程度。SOD是動物機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，其作用是清除自由基，防止自由基對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷。體內(nèi)SOD活性愈高，自由基清除速度愈快5。NO對肝臟既參與各種生理過程，又參與許多病理過程。NO在不同原因所致的肝損傷中所起的作用是不同的。在CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中，CCl4抑制NO的產(chǎn)生可明顯地增加肝內(nèi)的脂質(zhì)過氧化并加重肝損傷。而NO對急性肝損傷則可改善微循環(huán)，維持肝臟血液灌注，防止血栓形成，滅活氧自由基，可防止肝細(xì)胞凋亡6，7，從而減輕肝臟損傷，起到保護(hù)作用。ANIT是一種造成膽

18、汁瘀積的毒物。據(jù)文獻(xiàn)報道，ANIT于小鼠中毒后4872 h肝損傷明顯，肝細(xì)胞變性壞死，小葉間膽管增生，膽管上皮細(xì)胞腫脹，部分壞死的上皮細(xì)胞脫落后阻塞膽管，導(dǎo)致血清AST，ALT ，TBil顯著升高，故可作為退黃藥物研究的模型8。在本研究中，佛甲草提取液能有效地降低CCl4、ANIT所致急性肝損傷小鼠血清ALT，TBil含量，明顯減輕肝臟病理變化，說明受損的肝細(xì)胞得以恢復(fù)。表明佛甲草提取液能使肝細(xì)胞得以保護(hù)和修復(fù)，使間質(zhì)細(xì)胞的解毒和清除功能加強(qiáng)，具有顯著的抗肝損傷作用；佛甲草提取液能顯著降低CCl4所致急性肝損傷小鼠血清、肝組織MDA含量，提高SOD活性和NO3/NO2水平，表明佛甲草對小鼠四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制與其具有較強(qiáng)的清除體內(nèi)增多的脂質(zhì)過氧化物，促進(jìn)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的功能有關(guān)?？傊鸺撞萏崛∫簩嶒炐愿螕p傷具有明顯的降酶退黃保肝作用，可為臨床使用佛甲草治療肝病提供理論依