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文檔簡介

1、堿性磷酸酶Km值的測定【實驗目的】1 了解酶的Km值測定原理和方法 2.掌握堿性磷酸酶（AKP）活性測定的原理和方法【實驗原理】在溫度，PH及酶濃度恒定的條件下，酶促 反應的初速度隨底物濃度（S）增大而增加, 但當?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢O限時，則反應 速度趨于恒定，此最大反應速度Vm亦，反應速度與底物濃度之間的關系可用米氏方 程來表示，即：VmaxeSV=Km 4- S其中Km為米氏常數(shù)， Vmax為最大反應速度,當V二Vnwc/2時，則Km=soKm是酶的特征常數(shù)，測定Km是研究酶的一種方法將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程，以1/v1/S作圖，將各點連線，在橫軸截距為-/km,據(jù)此可算出Km值。 l/

2、V=Km/ VmaxeS + 1/ Vmax本實驗以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其 底物，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4一氨 基安替比林作用，經(jīng)鐵氤化鉀氧化生成紅色醞 的衍生物，根據(jù)紅色的深淺可測出酶活力高低。 其反應式如下：磷酸苯二鈉+H2OAKP OH苯酚苯酚+4氨基安替比林K3Fe(CN)6釀衍生物(紅色)【實驗操作】管號12345678底物液(0.04M)0.050.150.250.300.400.600.800.00碳酸緩 液(pH=10)0.900.900.900.900.900.900.900.90蒸館水0.950.850.750.700.600.400.201.00酶液0.

3、1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1加入酶液后立即混勻（保持37 C水?。? 反應開始。從加入酶液起計時至下一步加入堿性 溶液停止反應，各管反應時間應準確一 致，頭/15分鐘。4-氨基安替比林鐵氤化鉀堿性溶液 101.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.02.02.02.02.02.02.02.02.0混勻，室溫放置10分鐘左右，以8號管為空白，于510nm比色，記錄各管的光密度【實驗結果】1/S1、原始數(shù)據(jù)結果記錄1234567OD底物濃度13561216mmol/L10.333 0.2000.167 0.125 0.083 0.0631/OD2、作圖以s為橫軸，OD510為縱橫作圖，觀察曲線形狀；查Km值以1/ s為橫軸，1 / OD510為縱軸作 圖，觀察曲線形狀；查Km值比較兩個值的差異.底物濃度與反應速度關系曲線-1/Km一 S【實驗討論】比較兩個值的大小，分析實驗誤差產(chǎn)生

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