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1、本章 內(nèi)容1.RNA 轉(zhuǎn)錄的基本過程 2.轉(zhuǎn)錄機器的主要成分3.啟動子與轉(zhuǎn)錄起始4.原核與真核生物mRNA的特征比較5.終止和抗終止6.內(nèi)含子的剪接、編輯、再編碼及化學(xué)修飾第1頁/共70頁基因表達包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。 轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了TU之外）的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟。 翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。第2頁/共70頁 DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過蛋白質(zhì)（酶）的

2、功能間接控制了細胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。 與mRNA序列相同的那條DNA鏈是編碼鏈（coding strand）或稱有意義連（sense strand），另一條根據(jù)堿基互補原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈則被稱為模板鏈（template strand）或稱反義鏈（antisense strand）。第3頁/共70頁DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關(guān)系。第4頁/共70頁 DNA和RNA雖然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。 RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，它們既擔(dān)負著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核

3、酶直接在細胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。 因為只有mRNA所攜帶的遺傳信息才被用來指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來表示遺傳性狀。第5頁/共70頁生物體內(nèi)擁有三類RNA 編碼特定蛋白質(zhì)序列的mRNA； 能特異性解讀mRNA 中的遺傳信息并將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸后加入多肽鏈中的 transfer RNA （tRNA）； 直接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成的ribosomal RNA （rRNA）。第6頁/共70頁3. 1 RNA的轉(zhuǎn)錄的基本過程：無論是原核還是真核細胞，轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括：I.模板識別II.轉(zhuǎn)錄起始III.通過啟動子轉(zhuǎn)錄的延伸IV.轉(zhuǎn)錄的終止。第

4、7頁/共70頁 模板識別階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。 轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生。I 模板識別第8頁/共70頁大腸桿菌中依賴于DNA的RNA轉(zhuǎn)錄過程圖示。轉(zhuǎn)錄泡中單鏈DNA的長度約在17bp左右，被聚合酶復(fù)合物所保護的DNA序列約為35bp左右。第9頁/共70頁 真核生物RNA聚合酶不能直接識別基因的啟動子區(qū)，需要一些被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的輔助蛋白質(zhì)按特定順序結(jié)合于啟動子上，RNA聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物（preinitiatio

5、n transcription complex, PIC），以保證有效地起始轉(zhuǎn)錄。第10頁/共70頁轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始。II 轉(zhuǎn)錄的起始 (initiation)第11頁/共70頁 一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進入正常的延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。 一般說來，通過啟動子的時間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。第12頁/共70頁 RNA聚合酶離釋放因子，核心酶沿DNA鏈移動并使新生RNA

6、鏈不斷伸長的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。 大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。隨著RNA聚合酶的移動，DNA雙螺旋持續(xù)解開，暴露出新的單鏈DNA模板，新生RNA鏈的3末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。III 轉(zhuǎn)錄的延伸（elongation）第13頁/共70頁 當RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時 ，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂鍵。 RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解 DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài) RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來 IV 轉(zhuǎn)錄的終止 （termination）第14頁/共70頁37時，轉(zhuǎn)錄生成mRNA的速度大約是每分鐘2500個核苷酸，即每秒鐘合成1

7、4個密碼子，而蛋白質(zhì)合成的速度大約是每秒鐘15個氨基酸。正常情況下，從一個基因開始表達到細胞中出現(xiàn)其mRNA的間隔約為2.5分鐘，而再過半分鐘就能在細胞內(nèi)測到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。第15頁/共70頁3. 2 轉(zhuǎn)錄機器的主要成分1. RNA聚合酶 RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過程中最關(guān)鍵的酶，主要以雙鏈DNA為模板，以4種核苷三磷酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2+為輔助因子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產(chǎn)物是與DNA模板鏈相互補的RNA。第16頁/共70頁nCapable of polymerization but not initiation（1）RNA polymerase

8、 core enzyme第17頁/共70頁nCore enzyme + sigma factornThe sigma factor is a separate protein required for initiationnThere are many different sigma factorsnDifferent sigma factors allow for the expression of different genes（2）RNA polymerase holoenzymea a2 2bbbbs sa a2 2bbbb + s sholoenzyme core polymeras

9、e sigma factor第18頁/共70頁（3）各個亞基的功能 第19頁/共70頁Phosphodiester bond formationDNA bindingDNA bindingAssemble holoenzyme因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性序列相結(jié)合第20頁/共70頁The five subunits of the bacterial enzyme are distinguished by color. Only the N-terminal domains of the alpha subunits are included in this model.第21頁/共70頁 核

10、心酶 （Core Enzyme） 作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止） 依靠靜電引力與與DNA模板結(jié)合模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性 基團與DNA的磷酸根之 間） 非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無關(guān)） 結(jié)合常數(shù)：1011mol第22頁/共70頁全酶（Holo Enzyme） 用于轉(zhuǎn)錄的起始 依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合 (與核心酶結(jié)合后 引起的構(gòu)象變化) 專一性地與DNA序列(啟動子)結(jié)合 結(jié)合常數(shù)：1014mol 半衰期：數(shù)小時 轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（ 的結(jié)合 ）第23頁/共70頁 此外，新發(fā)現(xiàn)的一種亞基的功能尚不清楚。2、各亞基的特點和功能 （1） 因子（sigma factor） 因子可重復(fù)使用 修飾R

11、NApol構(gòu)型 使Holo Enzyme 識別啟動子的35區(qū),并通過與模 板鏈結(jié)合2 2 2 2（3）全酶的組裝過程第24頁/共70頁q 因子的作用是負責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識別模板上的啟動子。核心酶在T7噬菌體DNA上約有1300個結(jié)合位點，平均結(jié)合常數(shù)為21011。q因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力，酶底結(jié)合常數(shù)提高103倍，酶底復(fù)合物的半衰期可達數(shù)小時甚至數(shù)十小時。q因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點的結(jié)合常數(shù)降低104倍，使酶底復(fù)合物的半衰期小于1秒。第25頁/共70頁大腸桿菌中的因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性

12、序列相結(jié)合因子基因功能-35區(qū)間隔（bp）-10區(qū)70rpoD廣泛TTGACA16-18TATAAT32rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTA54rpoN氮代謝CTGGNA6TTGCA第26頁/共70頁 不同的不同的因子識別不同的啟動子因子識別不同的啟動子 E.coli 中有四種中有四種因子（因子（70、32、54、28） 枯草桿菌中有枯草桿菌中有6種種因子因子 （因子的更替對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）因子的更替對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）（2）因子 核心酶的組建因子核心酶的組建因子 促使促使RNA聚合酶與聚合酶與DNA模板鏈結(jié)合酶模板鏈結(jié)合酶 2 2 前端前端因子使模板因子使模板D

13、NA雙鏈解鏈為單鏈雙鏈解鏈為單鏈 尾端尾端因子使解鏈的單鏈因子使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈重新聚合為雙鏈第27頁/共70頁 （3） 因子 完成核苷酸底物之間的磷酸酯鍵的連接完成核苷酸底物之間的磷酸酯鍵的連接 Editing 功能（排斥與模板鏈不互補的堿基）功能（排斥與模板鏈不互補的堿基） 與與Rho （）因子競爭）因子競爭RNA 3end促進促進RNA聚合酶聚合酶NTP RNA elongation 第28頁/共70頁 （4） 因子因子 參與參與RNA非模板鏈（非模板鏈（sense strand）的結(jié)合）的結(jié)合 （充當（充當SSB） 第29頁/共70頁由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個功

14、能位點由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個功能位點 有義有義DNA鏈結(jié)合位點（鏈結(jié)合位點（ 亞基提供）亞基提供） DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點（雜交鏈結(jié)合位點（亞基提供） 雙鏈雙鏈DNA解鏈位點（前端解鏈位點（前端 亞基提供） 單鏈單鏈DNA重旋位點（后端重旋位點（后端亞基提供） 因子作用位點第30頁/共70頁Core Enzyme 具有的四個功能位點 DNA/RNA 雜交位點() D. S.DNA 解鏈位點() D. S.DNA 重旋() 啟動子識別位點 DNA有義鏈結(jié)合位點( ) 第31頁/共70頁nNo proofreading nuclease activitiesn1 error i

15、n 105 bpnAbout 105 lower than replicationThe fidelity（保真性） of RNA polymerase第32頁/共70頁 真核生物中的RNA 聚合酶 真核生物中有3類RNA聚合酶，其結(jié)構(gòu)比大腸桿菌RNA聚合酶復(fù)雜，它們在細胞核中的位置不同，負責(zé)轉(zhuǎn)錄的基因不同，對-鵝膏覃堿的敏感性也不同。 真核生物RNA聚合酶一般有8-14個亞基所組成，相對分子質(zhì)量超過5105第33頁/共70頁真核生物RNA聚合酶的主要特征 聚合酶中有兩個相對分子質(zhì)量超過1105的大亞基； 同種生物3類聚合酶有“共享”小亞基的傾向，即有幾個小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。

16、第34頁/共70頁真核細胞中三類RNA聚合酶特性比較第35頁/共70頁Ten of the twelve subunits constituting yeast RNA polymerase II are shown in this model. Subunits that are similar in conformation to those in the bacterial enzyme are shown in the same colors. The C-terminal domain of the large s u b u n i t R P B 1 w a s n o t ob

17、served in the crystal structure, but it is known to extend from the position marked with a red arrow.第36頁/共70頁第37頁/共70頁All three yeast polymerases havefive core subunits homologous , the two and subunits of E. coli RNA polymerase. The largest subunit (RPB1) of RNA polymerase II also contains an esse

18、ntial C-terminal domain (CTD). RNA polymerases I and III contain the same two nonidentical-like subunits, whereas RNA polymerase II contains two other nonidentical-like subunits. All three polymerases share the same -like subunit and four other common subunits. In addition, each yeast polymerase con

19、tains three to seven unique smaller subunits.第38頁/共70頁2. 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物 啟動子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對啟動子的識別，聚合酶與啟動子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物(closed complex)，此時，DNA仍處于雙鏈狀態(tài)。 然后，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開放復(fù)合物 (open complex)，聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。對于強啟動子來說，從封閉復(fù)合物到開放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。第39頁/共70頁 開放復(fù)合物與最初的兩個NTP相結(jié)合并在這兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后即轉(zhuǎn)變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三

20、元復(fù)合物。除RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與。第40頁/共70頁一般情況下，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可以進入兩條不同的反應(yīng)途徑1.合成并釋放2-9個核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；2.盡快釋放亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。第41頁/共70頁轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物較為穩(wěn)定，可長時間與DNA模板結(jié)合而不解離。只有在遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導(dǎo)致聚合酶本身從模板DNA上脫落。第42頁/共70頁3.3 啟動子與轉(zhuǎn)錄的起始啟動子(promoter

21、)：是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域 ，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點。第43頁/共70頁原核生物的啟動子I . 轉(zhuǎn)錄起始點轉(zhuǎn)錄起始點在多數(shù)情況下為嘌呤（90%），常見的序列為CAT， A為轉(zhuǎn)錄的起始點。第44頁/共70頁II. -10序列 （Pribonow Box）-10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點,結(jié)合位點（B 位點）一致序列：(T80A95T45A60A50T96 ）因此又稱TATA Box位置范圍 -18 bp 到-9 bp保守保守TTATA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開） 第45頁/共70頁III. -35序列序列 （Sex

22、tama Box） -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點 RNA聚合酶依靠其亞基識別該位點 大多數(shù)啟動子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上決定了啟動子的強度 位置在不同啟動子中略有變動TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識別的信號 第46頁/共70頁IV. -10區(qū)和-35區(qū)間距離區(qū)間距離 在90%的原核生物中為 16到18bp 適宜的距離能為 RNA聚合酶提供合適的空間結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄的起始。 典型的原核生物的啟動子結(jié)構(gòu)為 -35， 1619bp的間隔區(qū)， -10區(qū)和 轉(zhuǎn)錄 起始點， -10區(qū)到轉(zhuǎn)錄起始點的距離 為 7bp。第47頁/共70頁大腸

23、桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)第48頁/共70頁 RNA polymerase scans DNA linearly Slides along DNA without opening strands Detects sequences of -10 and -35 in the major groove Sigma factor allows RNA polymerase to bind to promoter 原核生物轉(zhuǎn)錄的起始 第49頁/共70頁 A. 全酶與啟動子結(jié)合的封閉型啟動子復(fù)合物的形成全酶與啟動子結(jié)合的封閉型啟動子復(fù)合物的形成 （ R位點被位點被因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合 ） B. 開

24、放型啟動子復(fù)合物的形成開放型啟動子復(fù)合物的形成 RNApol的一個適合位點到達的一個適合位點到達10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富序列區(qū)域，誘導(dǎo)富 含含AT的的Pribnow 框的框的“熔解熔解”， 形成形成1217bp的泡狀物，的泡狀物，同時酶分子向同時酶分子向10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合 開放型啟動子復(fù)合物使開放型啟動子復(fù)合物使RNA聚合酶定向聚合酶定向 兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和DNA ）第50頁/共70頁 c. 在開放型的啟動子復(fù)合物中，在開放型的啟動子復(fù)合物中，RNApol的的I位點和位點和E位點的位點的 核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（

25、核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（ 亞基）亞基） 三元復(fù)合物形成三元復(fù)合物形成 +1位多為位多為CAT模式模式,位于離開保守位于離開保守T 69 個核苷酸處個核苷酸處 -6-9 bp- GC T ATTGACATATAAT-16-19 bp-+1-35 sequence-10 sequence（4） 因子解離 核心酶與核心酶與DNA的親和力下降的親和力下降 起始過程結(jié)束起始過程結(jié)束核心酶移動進入延伸過程核心酶移動進入延伸過程第51頁/共70頁轉(zhuǎn)錄的起始過程轉(zhuǎn)錄的起始過程核心酶核心酶1217bp第52頁/共70頁（亞基）亞基）第53頁/共70頁啟動子各位點與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系啟動子各位點與轉(zhuǎn)錄效率的

26、關(guān)系（1）35 序列與序列與10 序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 標準啟動子標準啟動子 35 TTGACA 10 TATAAT第54頁/共70頁不同的啟動子的區(qū)別：不同的啟動子的區(qū)別： a. 與標準啟動子序列同源性越高與標準啟動子序列同源性越高 啟動強度越大啟動強度越大 b. 與標準啟動子同源性越低與標準啟動子同源性越低 啟動強度越小啟動強度越小 c. 與標準啟動子差異很大時與標準啟動子差異很大時 由另一種由另一種因子啟動因子啟動 原因原因 -35序列通過被序列通過被 因子識別的容易程度因子識別的容易程度決定啟動子強決定啟動子強度度 -10序列影響開放型啟動子復(fù)合物形成的速度序列影響

27、開放型啟動子復(fù)合物形成的速度 決定啟決定啟動子強度動子強度 第55頁/共70頁 （2） 35序列與10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 堿基序列并不重要 間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高 間距上的突變種類： 間距趨向于17bp 上升突變 間距遠離17bp 下降突變第56頁/共70頁 1、 RNA聚合酶的啟動子 結(jié)構(gòu)最復(fù)雜 位于轉(zhuǎn)錄起始點的上游,有多個短序列元件組成 通用型啟動子（無組織特異性）（1）TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框）位于-25 -30處 一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37)定位轉(zhuǎn)錄起始點的功能 ,類似

28、原核生物的-10序列的序列的Pribnow框TATA框是絕大多數(shù)真核基因的正確表達所必需的 真核生物的啟動子第57頁/共70頁（2） CAAT框（CAAT box） 位于-70-80區(qū)處 一致序列為GGC/TCAATCT 前兩個 G 的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率) 增強啟動子的效率、頻率，不影響啟動子的特異性（3） GC框（GC box） 在-80-110區(qū)，含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（4） 帽子位點 轉(zhuǎn)錄起始位點，堿基大多為A 以上三個保守序列在絕大多數(shù)啟動子中都存在第58頁/共70頁RNA聚合酶的啟動子結(jié)構(gòu)第59頁/共70頁 （5 5）增強子（enhancer）：能強化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強子或強化子。又稱遠上游序列（far upstream sequence）它是遠距離調(diào)節(jié)啟動子以增加轉(zhuǎn)錄速率的DNADNA序列，其增強作用與序列的方向無關(guān)，與它在基因的上下游位置無關(guān)。增強子有強烈的細胞類型選擇，即不同細胞類型，增強作用不同。第60頁/共70頁Binding of Activator Factors Finally, high-level transcription is induced