分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名: 專(zhuān)業(yè): 植物病理學(xué)號(hào): 實(shí)驗(yàn)一 水稻總DNA的提取一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)水稻葉片DNA的提取,掌握提取植物DNA的原理和方法二. 實(shí)驗(yàn)原理十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡(jiǎn)稱(chēng)為CTAB), 是離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA釋放出來(lái)。再加入氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無(wú)水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。三. 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 材料

2、:水稻葉片（一般把種子放到培養(yǎng)皿中，讓它長(zhǎng)到三葉一心時(shí)即可，當(dāng)然也可以從田間采集嫩的水稻葉片來(lái)提取DNA）實(shí)驗(yàn)方法: CTAB法試劑: 液氮，CTAB提取液, 氯仿/異戊醇（24：1）,冰乙醇, 70%乙醇, 超純水儀器:臺(tái)式離心機(jī),水浴鍋,移液槍,槍頭, 1.5mL或2mL離心管四. 實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下： 將洗凈的培養(yǎng)皿內(nèi)墊上一層濾紙，將水稻種子置于濾紙上，用脫脂棉固定種子，加水保濕，將其移至光照培養(yǎng)箱（28，濕度90%，光照12小時(shí)）。一周后即可發(fā)芽，發(fā)芽后移栽到土里，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，即可作為提取DNA的材料。 取三葉一心的水稻幼苗一株，將

3、其剪碎后置于研缽中加液氮研磨成粉末狀，移至已滅菌的2.0mL離心管，一般加到離心管的1/3體積。 在離心管中加入已在65預(yù)熱的600L2%CTAB提取液（0.1M Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），8%NaCl，2%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），也可根據(jù)樣品量適當(dāng)增加提取液的量，上下顛倒混勻，置于65水浴鍋保溫30min-1h。 將樣品從水浴鍋中取出，加入與提取液等體積600L的氯仿/異戊醇（24：1），上下顛倒離心管使之充分混勻，12,000rpm離心15min。 吸取上清液500L置于已滅菌的1.5mL離心管，再加入等體積500L的氯仿/異戊醇（24：1

4、），上下顛倒離心管使之充分混勻，12,000rpm離心15min。 吸取上清液450L置于已滅菌的1.5mL離心管，加入同體積450L在-20預(yù)冷的冰乙醇，輕輕顛倒離心管使之混勻，置于-20冰箱，放置2h以上，沉淀DNA。 10,000rpm離心10min，倒去上清液，保留沉淀。質(zhì)量好的DNA應(yīng)為無(wú)色透明膠狀物體。 加入400L70%乙醇漂洗兩次除去雜質(zhì)，10,000rpm離心5min，收集沉淀。置于無(wú)菌工作臺(tái)風(fēng)干，直到管底無(wú)水珠，此時(shí)DNA應(yīng)為肉眼不可見(jiàn)。 加入100LTE緩沖液（10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA（pH8.0）或滅菌超純水溶解DNA。最后將提好的水稻

5、DNA放-20冰箱保存?zhèn)溆梦? 注意事項(xiàng)1. 提取DNA時(shí)材料應(yīng)選擇幼嫩葉片,因?yàn)槟廴~中DNA含量高老葉片含很多色素，糖等成分，會(huì)對(duì)DNA的質(zhì)量有影響。2. 葉片磨得盡可能細(xì)，一般磨成粉狀即可。根據(jù)本人經(jīng)驗(yàn)葉片的粗細(xì)對(duì)DNA 質(zhì)量沒(méi)有多大影響;關(guān)鍵是磨好的葉片粉狀加到離心管里，不能加得太多，其次是CTAB的量要夠（依據(jù)水稻葉片粉末的量而定）。3. 為了得到質(zhì)量較好的DNA或減少蛋白質(zhì)的的量，應(yīng)該用氯仿/異戊醇多抽提幾次，對(duì)于老葉片一般至少要抽提3次。當(dāng)然，有條件的話(huà)，最好再用酚抽提一次，以除去蛋白質(zhì)，甚至可以加入RNase去除RNA，這樣電泳出來(lái)的DNA才會(huì)沒(méi)有蛋白質(zhì)和RNA。實(shí)驗(yàn)二 水稻基因

6、組DNA濃度檢測(cè)一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳檢測(cè)DNA的方法二. 實(shí)驗(yàn)原理溴化乙錠或花青素可以插入到DNA配對(duì)的兩堿基之間，當(dāng)在紫外燈照射下會(huì)激發(fā)熒光，從而可以看到DNA條帶.（由于溴化乙錠有毒，所以本實(shí)驗(yàn)用花青素）；由于DNA含有磷酸基故帶負(fù)電，在電泳過(guò)程中會(huì)向正極遷移。遷移率與它的電荷數(shù)和分子量有關(guān)，分子量越大，遷移率越小。三. 實(shí)驗(yàn)材料及儀器實(shí)驗(yàn)方法: 采用花青素或溴化乙錠熒光染色法檢測(cè)基因組DNA濃度試劑: 上樣緩沖液Loading buffer/花青素(39/1),0.5TBE, 1%瓊脂糖儀器: 電泳儀四. 實(shí)驗(yàn)步驟本 取2LDNA樣品與2L上樣緩沖液loading buffe

7、r（98%甲酰胺、10mM EDTA、0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青）（添加花青素，比例為39：1）混合，將樣品加入到0.8%瓊脂糖凝膠膠孔中，同時(shí)配置已知量的標(biāo)準(zhǔn)DNA（DNA）溶液（分別為：25ng/L、50ng/L、100ng/L 200ng/L）作為對(duì)照。200V電泳15min，根據(jù)DNA條帶的亮度與標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)比，判斷樣品DNA濃度。五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果分析：部分泳道沒(méi)有DNA。從總體上看，很顯然DNA里的蛋白質(zhì)沒(méi)有抽提干凈，最好的解決方法是在把DNA用酚或氯仿抽提幾次，甚至可以加入RNase去除RNA，如果要加RNase去除RNA，之后還要在抽提一次，因?yàn)镽Nase也屬于蛋白質(zhì)

8、。六. 注意事項(xiàng)1. DNA樣品與上樣緩沖液要混勻2. 膠的濃度一般為0.8%1.0%。如果緩沖液是TAE一般用一兩次就應(yīng)該換，對(duì)于TBE可以用的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。3. 雖然電泳15min作用即可看到有無(wú)DNA條帶，但有時(shí)可以相對(duì)延長(zhǎng)一點(diǎn)，因?yàn)镽NA分子量較小，電泳時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)是它跑出去，這樣電泳圖就相對(duì)干凈一些。實(shí)驗(yàn)三 PCR擴(kuò)增一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釶CR的基本原理；掌握PCR實(shí)驗(yàn)的操作方法；二. 實(shí)驗(yàn)原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下,在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)

9、，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。三. 實(shí)驗(yàn)材料及儀器PCR擴(kuò)增儀四. 實(shí)驗(yàn)步驟本SSR引物的選取 選擇多態(tài)性豐富的引物。按下列反應(yīng)體系和方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 根據(jù)下表配置反應(yīng)混和液（一個(gè)反應(yīng)體系）試劑儲(chǔ)液濃度體積（L）終濃度ddH2O12.36PCR buffer102.01dNTP 2.0 mM2.00.2 mMMgCl225 mM1.341.675 mMPrimer-f20M0.50.5MPrimer-r2

10、0M0.50.5MTaqase5 units0.31 unit合計(jì)19.0 取19L配好的反應(yīng)混和液加入0.5mLPCR管中，再取1L（約25ng）模板DNA置于該P(yáng)CR管中，振蕩、離心混勻，其上滴一滴（約10L）石蠟油。 將混勻的反應(yīng)體系置于PTC10096vPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：1） 預(yù)變性，94，5min；進(jìn)入36個(gè)循環(huán)2） 變性，94，40sec；3） 退火，55，30sec；4） 延伸，72，40sec；5） 最后在72延伸10min，產(chǎn)物在4保存。五. 注意事項(xiàng)1.配置體系時(shí)Taqase要最后加,加完后馬上放回-20保存,以免酶變性;如果是電泳量是很多，最好是先配好

11、反應(yīng)體系，分成若干管，最后在加入DNA從而可以提高效率。2.變性：模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94（或95）變性310min，這個(gè)時(shí)間是由DNA決定的，如果是基因組DNA變性時(shí)間可以在5min以上，如果是一個(gè)DNA片段，則時(shí)間可以是3-5min就足夠。3.退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5。引物長(zhǎng)度在1525bp可通過(guò)公Tm=(G C)4 (A T)2計(jì)算退火溫度，一般退火溫度在4060之間，時(shí)間為3045s。如果(G C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。4.延伸之后，最后在72延伸10min，已獲得更多的PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)四 PCR產(chǎn)物的

12、檢測(cè)一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誔CR產(chǎn)物的檢測(cè)方法二. 實(shí)驗(yàn)原理 溴化乙錠或花青素可以插入到DNA配對(duì)的兩堿基之間，當(dāng)在紫外燈照射下會(huì)激發(fā)熒光，從而可以看到DNA條帶.（由于溴化乙錠有毒，所以本實(shí)驗(yàn)用花青素）；DNA于帶有磷酸基故帶負(fù)電，當(dāng)在電泳過(guò)程中會(huì)向正極遷移。遷移率與它的電荷數(shù)和分子量有關(guān)，分子量越大，遷移率越小。三. 實(shí)驗(yàn)材料及儀器電泳儀，1.2%瓊脂糖膠，6%聚丙烯酰胺凝膠四. 實(shí)驗(yàn)步驟1.PCR產(chǎn)物的檢測(cè) PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖膠檢測(cè)，Marker為DL2000(6個(gè)條帶：100、250、500、750、1000、2000bp) ，根據(jù)DNA條帶的位置與DL2000對(duì)比，判斷樣品DNA

13、大小。 PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠分離，再經(jīng)染色和顯影，即可見(jiàn)清晰的DNA條帶。電泳在DYCZ-28B（D）型電泳槽（北京六一儀器設(shè)備廠(chǎng)）上進(jìn)行。2.PCR產(chǎn)物的變性加與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等量的上樣緩沖液（Loading Buffer）至裝有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的離心管中，用旋渦混合器混勻后，4,000 rpm/min離心片刻（幾十秒），955min變性，然后立即置于冰上或4冰箱。3.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1500bp到2000bp之間，與預(yù)期條帶大小吻合。4.垂直板電泳1）6%聚丙烯酰胺凝膠的制備 用洗滌劑清洗玻璃，直到水不聚集成滴也不成股下流，然后將玻璃晾干。 取晾干的長(zhǎng)短玻璃

14、各一塊，裝好封條，用夾子夾緊，用1.0%瓊脂糖凝膠（用前加熱熔化）封住底邊。 在燒杯中配置60mL6%聚丙烯酰胺凝膠（配制方法見(jiàn)附錄），最后加變性劑過(guò)硫酸胺和TEMED。 用燒杯將溶液緩緩倒入兩塊玻璃板間，防止產(chǎn)生氣泡。倒?jié)M后插上梳子。 灌膠1小時(shí)后即可使用，也可將膠放置過(guò)夜。待膠凝固后在兩塊玻璃的缺口處加少許1TBE以防止干燥。2)上樣和電泳 凝膠制好后拔掉梳子。 在槽中加入1TBE，液面不能低于短玻璃的上邊。 接通電源，300V預(yù)電泳半小時(shí)。 預(yù)電泳結(jié)束后關(guān)閉電源。取變性后的樣品1.2L加入點(diǎn)樣孔，300V恒定電壓電泳約1小時(shí)20分鐘，直至二甲苯青帶（藍(lán)色帶）跑至膠的三分之二處，電泳結(jié)束。

15、3)染色及顯影 電泳完成后，從膠板上剝離的膠置于200-400mL 0.075%AgNO3溶液中染色15-20min； 用去離子水漂洗1-2次，將膠置于200-400mL 1.5%NaOH溶液（其中還含0.4%甲醛）中顯影，10-15min后可見(jiàn)清晰的DNA條帶； 用數(shù)碼相機(jī)拍照，存入電腦已備統(tǒng)計(jì)。4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果右邊數(shù)除了marker 第一條條帶為本人實(shí)驗(yàn)結(jié)果。六注意事項(xiàng)1.制垂直板時(shí),兩側(cè)的夾子不能太緊,否則制出的膠厚薄不均，而且還可能會(huì)導(dǎo)致電泳過(guò)程中局部溫度過(guò)高，造成玻璃板破裂。此外，所加DNA和buffer的量不能過(guò)多，若過(guò)多則電泳出來(lái)的結(jié)果反而不清晰。2.底部和兩側(cè)一定要用瓊脂糖膠封嚴(yán)實(shí),保證不能漏膠；否則會(huì)造成所制的聚丙烯酰胺膠不夠。3. 在染色過(guò)程中最好左右或前后晃動(dòng)盤(pán)子，從而使