血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、血管緊張素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究(一)    作者：張建鄂, 羅昌霞, 張慶紅, 李濤摘要 目的:研究血管緊張素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。 方法:血管緊張素（10-7 mol/l）加入腎小管上皮細(xì)胞為對(duì)照組；體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞作為空白對(duì)照；不同濃度纈沙坦（10-6 mol/l、10-7 mol/l、10-8 mol/l、10-9 mol/l）先與腎小管上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)半小時(shí)后再加入血管緊張素（10-7 mol/l）為干預(yù)組；EMSA、RT-PCR分別檢測(cè)不同時(shí)限NF-B活性、骨橋蛋白mRNA表達(dá)。 結(jié)果:血管緊張素可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞

2、內(nèi)NF-B活性增加，骨橋蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)；而不同濃度纈沙坦干預(yù)組檢測(cè)結(jié)果顯示NF-B活性、骨橋蛋白mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。 結(jié)論:血管緊張素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷與導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-B活性增加、骨橋蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)有關(guān)。這一過(guò)程可能依賴血管緊張素型受體。關(guān)鍵詞 血管緊張素;腎小管上皮細(xì)胞;核轉(zhuǎn)錄因子-B;骨橋蛋白Abstract： Objective To explore the mechanism of angiotensininducing the injury of proximal tubular cells. Methods Cultured cells were in

3、cubated with Angiotensin（10-7 mol/l）as the control; cultured cells were incubated with different concentration Xiesartan for half an hour and then with angiotensin（10-7mol/l） as the intervention group; proximal tubular cells without stimulation as blank control; EMSA, RT-PCR were used to observe NF-

4、B activity and OPN mRNA expression in different periods,respectively. Results Angiotensincould increase NF-B activity and upregulate OPN mRNA expression in proximal tubular cells.While Xiesartan could decrease NF-B activity and downregulate OPN mRNA expression in angiotensin stimulated proximal tubu

5、lar cells. Conclusion The mechanism of angiotensin inducing the injury of proximal tubular cells is related to increase NF-B activity and upregulate OPN mRNA expression,and this process is angiotensin receptor dependent.Key words: Angiotensin; Proximal tubular cell; NF-B; OPN 近年來(lái)，腎臟局部腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RA

6、S）在慢性腎臟病的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。RAS的主要效應(yīng)因子血管緊張素（Angiotensin ）已發(fā)現(xiàn)與許多腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。但血管緊張素能否誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞損傷及其具體機(jī)制不明。本課題通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)用一定濃度血管緊張素刺激腎小管上皮細(xì)胞，觀察核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子的變化，探討血管緊張素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。1 材料與方法1.1 主要試劑及儀器測(cè)定NF-B活性的EMSA試劑盒（promega公司）；血管緊張素 （sigma公司）；RT-PCR試劑盒（BD Bioscience公司）；TRIZOL（GiBco公司）；RNaseA抑制劑（Novage

7、n 公司）；引物（上海生工生物工程技術(shù)公司）；大鼠的腎小管上皮細(xì)胞株(NRK細(xì)胞)購(gòu)至中科院上海細(xì)胞庫(kù)；冷凍離心機(jī)（Biofuge公司），二氧化碳溫箱（Forma scientific公司）。纈沙坦由北京諾華公司提供。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下大鼠腎小管上皮細(xì)胞株，0.25%胰酶消化2 min，觀察細(xì)胞分散成拉網(wǎng)狀，終止消化，加入RPMI 1640培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，300 mg/l谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素）反復(fù)吹打，并分裝至培養(yǎng)皿，置于37 二氧化碳溫箱中孵育；反復(fù)傳代，取第七代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用。1.3 實(shí)驗(yàn)分組當(dāng)傳代細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。試驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照

8、:未加刺激物的培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)照組:血管緊張素（10-7 mol/l）加入培養(yǎng)細(xì)胞，分別于12、24 h檢測(cè)NF-B活性； 12、24 h檢測(cè)骨橋蛋白 mRNA表達(dá)水平；每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)五個(gè)重復(fù)組。干預(yù)組:不同濃度纈沙坦（10-6 mol/l、10-7 mol/l、10-8 mol/l、10-9 mol/l）加入培養(yǎng)細(xì)胞，半小時(shí)后再加入血管緊張素（10-7 mol/l），分別于12 h檢測(cè)NF-B活性；12 h檢測(cè)骨橋蛋白 mRNA表達(dá)水平；每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)五個(gè)重復(fù)組。1.4 EMSA的操作步驟核蛋白的提取Bradford法定量。EMSA 的操作依試劑盒說(shuō)明書(shū)（Cat#3050）進(jìn)行NF-B寡核苷

9、酸探針r-32pATP標(biāo)記及EMSA法測(cè)定NF-B活性。NF-B同序寡核苷酸探針序列為3-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5；5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3。反應(yīng)結(jié)束后，在4%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h（電壓150 V，電泳緩沖液為0.5×TBE）。電泳完畢后干膠， -70 放射自顯影。電泳結(jié)果經(jīng)密度掃描儀進(jìn)行半定量分析。1.5 骨橋蛋白的RT-PCR操作步驟培養(yǎng)細(xì)胞接種至12孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%90%融合時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)液，12 h后按試驗(yàn)分組加藥物干預(yù)，每組細(xì)胞均設(shè)五個(gè)復(fù)孔。TRIZOL提取總RNA，并測(cè)定濃

10、度及260/280 nm的吸光度（A）值。按T1TANIUMTM one-step RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：50 1 h，90 5 min； 94 30，65 30， 68 1 min 30個(gè)循環(huán)；68 延伸2 min，4 保存。骨橋蛋白上游引物序列：5AAGCCTGACCCATCTCAGAA 3； 骨橋蛋白下游引物序列為： 5GCAACTGGGATGACCTTGAT 3，產(chǎn)物長(zhǎng)度446 bp；設(shè)-actin為內(nèi)參照，其上流引物序列為5-TCGTACCACTGGCATTGTGA-3，下游引物序列為5-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度545 bp。Mark

11、片段選用2 000 bp。電泳分析:取8 l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為1.5 g/l的瓊脂糖凝膠上電泳，采用kodak scieuce凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，并分析電泳條帶，以O(shè)PN與-actin的電泳條帶光密度比值來(lái)作為OPN mRNA的相對(duì)表達(dá)量。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，差異的顯著性采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)，以P0.05為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 EMSA法測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖1)圖1中17泳道的密度掃描值依次為：36.30±8.73,194.50±10.45,186.30±12.30,76.34

12、77;4.57,90.34±5.86,114.60±7.67,138.41±6.53；n=5（每組細(xì)胞均設(shè)五個(gè)重復(fù)組）。未加刺激的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-B表達(dá)較弱；血管緊張素（10-7 mol/l）刺激腎小管上皮細(xì)胞后NF-B活性明顯增高，以12 h最明顯，為空白對(duì)照的5.47倍（P0.05）；24 h為空白對(duì)照的4.97倍（P0.05）；不同濃度纈沙坦12 h可抑制血管緊張素刺激的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-B活性，抑制作用依次為10-6 mol/l>10-7 mol/l>10-8 mol/l>10-9 mol/l（P0.05）。圖1 各組NF-B活

13、性的變化（略）注: 1.空白對(duì)照；2.血管緊張素10-7 mol/l 12 h；3.血管緊張素10-7 mol/l 24 h；4、5、6、7泳道分別為10-6 mol/l 12 h、10-7 mol/l 12 h、10-8 mol/l 12 h、10-9 mol/l 12 h；2.2 骨橋蛋白R(shí)T-PCR檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖2)17泳道OPN與-actin的電泳條帶的光密度比值依次為：17泳道依次為0.20±0.05，0.97±0.049，0.85±0.014，0.17±0.032，0.37±0.017，0.60±0.031，0.28

14、77;0.012；n=5；經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組及組間相比均有顯著差異，P0.05。從結(jié)果分析：未加刺激的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)骨橋蛋白轉(zhuǎn)錄較弱，而血管緊張素（10-7 mol/l）誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)骨橋蛋白轉(zhuǎn)錄增加，12 h達(dá)高峰，并持續(xù)至24 h；不同濃度纈沙坦可抑制血管緊張素刺激的腎小管上皮細(xì)胞骨橋蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，抑制作用依次為10-6 mol/l>10-7 mol/l>10-9 mol/l>10-8 mol/l（P0.05）。圖2 各組OPN mRNA水平的變化（略）注：M:DNA Mark； 1、空白對(duì)照; 2、血管緊張素10-7 mol/l 12 h； 3、血管緊張素1

15、0-7 mol/l 24 h； 4、 5、6、7泳道分別為纈沙坦10-6 mol/l 12 h、10-7 mol/l 12 h、10-8 mol/l 12 h、10-9 mol/l 12 h。3 討論腎臟局部腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAS）在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用已倍受重視， 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑應(yīng)用臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，血管緊張素在小管間質(zhì)病變中發(fā)揮重要作用1。近年來(lái)，大量研究結(jié)果表明2，腎小管間質(zhì)病變較腎小球病變更密切相關(guān)于腎功能的損傷和預(yù)后。小管間質(zhì)病變?cè)谶M(jìn)行性腎小球損傷中的重要性已經(jīng)被越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視。在小管間質(zhì)損害過(guò)程中腎小管上皮細(xì)胞扮演著重要的

16、角色。但血管緊張素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制不明。NF-B作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的B位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，參與許多基因，尤其是炎癥與免疫相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控。許多刺激，如：腫瘤壞死因子（TNF-）、高糖、血小板活化因子、細(xì)胞因子等可激活NF-B3。NF-B游離并移入核內(nèi),調(diào)控炎癥與免疫相關(guān)的基因的表達(dá)。在胞漿中還存在另一種蛋白質(zhì)家族-IB，它的主要作用是與NF-B/Rel蛋白在胞漿中結(jié)合并使后者保持靜息狀態(tài)。NF-B在核內(nèi)與新合成的IB結(jié)合后出核，進(jìn)入胞漿，從而失活。本課題通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)用血管緊張素（10-7 mol/l）刺激腎小管上皮細(xì)胞，

17、EMSA檢測(cè)結(jié)果顯示NF-B活性升高，12 h達(dá)高峰，并持續(xù)至24 h，說(shuō)明一定濃度血管緊張素可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞NF-B活性升高，與隨后的炎癥、纖維化基因的過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)。骨橋蛋白是一種可以在腎小管上皮表達(dá)的高度酸化的磷蛋白，現(xiàn)認(rèn)為它是巨噬細(xì)胞趨化因子。而在許多病腎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕希òㄈ毖俟嘧p傷）發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)。目前針對(duì)臨床腎臟疾病的研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在伴有蛋白尿的腎小球疾病如微小病變性腎病、膜性腎病、IgA腎病的腎小管上皮細(xì)胞處高表達(dá)，均與小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān)4-5。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)用血管緊張素（10-7 mol/l）刺激腎小管上皮細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示共同培養(yǎng)后骨橋蛋白的轉(zhuǎn)錄增加

18、，在12 h達(dá)高峰并持續(xù)至24 h，與血管緊張素（10-7 mol/l）誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-B活性改變相一致，證實(shí)血管緊張素（10-7 mol/l）可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)骨橋蛋白的轉(zhuǎn)錄增加，這可能與腎小管間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。通過(guò)對(duì)不同濃度纈沙坦共同培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞的測(cè)定，在相同刺激下其NF-B活性及骨橋蛋白的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，從實(shí)驗(yàn)角度說(shuō)明纈沙坦用于慢性腎臟病的治療機(jī)制與抑制血管緊張素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-B活性及骨橋蛋白的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，因纈沙坦屬血管緊張素 型受體拮抗劑，我們推測(cè)血管緊張素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞NF-B及OPN mRNA活性上調(diào)依賴于血管緊張素 型受體。通過(guò)本研究證實(shí)血管緊張素可誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-B活性明顯增加，骨橋蛋白轉(zhuǎn)錄增加，與炎性細(xì)胞小管間質(zhì)浸潤(rùn)密切相關(guān)，并且這一過(guò)程依賴AGN 型受體。但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍需深入研究。參考文獻(xiàn)1 Lai KN,Chan LY,Tang SC,et al.Mesangial expression of angiotensin recept