氨基酸的分離鑒定(紙層析法)

1、氨基酸的分離（紙層析法）一、實(shí)驗(yàn)原理1、層析法又稱色譜法，是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相兩相中，并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而得到有效的分離。操作方式：紙層析、薄層層析、柱層析等分離機(jī)理：分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析等2、紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，展層溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。濾紙纖維上的羥基具有親水性，在濾紙上水就被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當(dāng)有機(jī)溶劑（流動(dòng)相）沿紙流動(dòng)經(jīng)過層析點(diǎn)時(shí)，層析法上溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行分配

2、。由于溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行分配。由于溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。物質(zhì)被分離后在濾紙上的移動(dòng)速率用 值表示：只要條件（如溫度、展層溶劑的組成）不變， 值是常數(shù)，故可根據(jù) 值作定性依據(jù)。氨基酸無色，利用茚三酮反應(yīng)，可將氨基酸層析點(diǎn)顯色作定性、定量用。二、實(shí)驗(yàn)器材標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液、濾紙、層析缸、保鮮膜、剪刀、毛細(xì)管、電吹風(fēng)。三、實(shí)驗(yàn)試劑1、酸相溶劑：V正丁醇（A.R）：V88%甲酸：V水=15：3：22、顯色貯備液：V（0.4mol/L茚三酮-異丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5四、實(shí)驗(yàn)操作1、點(diǎn)樣量取30mL層析溶劑、1mL顯色貯備液于層析缸中，

3、混勻密閉，靜置。戴好手套，在桌上鋪好一層保鮮膜。取一張干凈濾紙，將其剪彩為18cm*14cm。在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線上等距離分出幾個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。用毛細(xì)管將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和未知樣品分別點(diǎn)在點(diǎn)樣點(diǎn)上，每次點(diǎn)樣后用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干再點(diǎn)下一次，點(diǎn)樣點(diǎn)直徑不超過5mm。2、層析與顯色將濾紙卷成圓筒形，用釘書針固定成圓筒狀，紙的兩邊不能接觸。將濾紙垂直放入盛有展層劑的層析缸中，迅速蓋緊層析缸蓋（點(diǎn)樣點(diǎn)的一端朝下，展層劑液面需低于點(diǎn)樣線1cm左右）。待溶液前沿線距濾紙末端12cm（展層長(zhǎng)度10cm，約2h）后，取出濾紙（需帶上手套），用鉛筆將前沿線作一標(biāo)記。剪去縫合線，電吹風(fēng)熱

4、風(fēng)吹干（通風(fēng)櫥中進(jìn)行），即可看見層析斑點(diǎn)。3、結(jié)果處理用鉛筆將層析圖譜上的斑點(diǎn)圈出，分別測(cè)量點(diǎn)樣點(diǎn)到層析點(diǎn)中心和點(diǎn)樣點(diǎn)到層析前沿的距離，計(jì)算各種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的 值，并根據(jù)樣品分離的情況鑒定混合樣品中氨基酸的組分。五、結(jié)果與討論1、層析圖譜2、數(shù)據(jù)處理GlyPheProHis樣品Y09中心到原點(diǎn)距離/cm0.43.751.651.600.4501.203.71前沿/cm10.39.759.559.509.85/cm0.03880.3850.1730.1680.04570.1220.377參考 值0.300.730.480.113、將樣品的層析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸層析圖譜對(duì)比得出，樣品中含有的氨基酸是：

5、苯丙氨酸、脯氨酸和組氨酸。樣品層析圖譜中最下方的斑點(diǎn)難以判斷是組氨酸還是甘氨酸，結(jié)合 值和斑點(diǎn)的形狀與顏色，初步判斷是組氨酸。4、本次層析的結(jié)果不好，各標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的 值與參考值相差較大（偏小），且樣品的層析方向不垂直，斑點(diǎn)的朝向也不一致。如果僅僅是層析時(shí)紙筒沒有放平，也不可能出現(xiàn)斑點(diǎn)朝向不一致的現(xiàn)象。將有層析結(jié)果的濾紙放置兩天后，變成了以下情形：圖中顯示，層析溶劑出現(xiàn)了明顯的分層（水相和有機(jī)相），可能是因?yàn)閷游龈變?nèi)壁有較多水，破壞了溶劑的比例。由于正丁醇與水的互溶有一定限度，過多的水與有機(jī)相無法互溶。到層析后期，有機(jī)相大部分到濾紙上時(shí)，水相開始接觸濾紙并向上移動(dòng)。由于水相的存在切斷了有機(jī)相與下

6、方溶液的通路，有機(jī)相無法再向上移動(dòng)，而水相不斷在擴(kuò)大其“勢(shì)力范圍”。因?yàn)橛袡C(jī)相無法繼續(xù)上移，有機(jī)相中溶解的氨基酸也無法隨溶液移動(dòng)，因此 值也測(cè)不準(zhǔn)確。由圖可以看出，層析斑點(diǎn)的形狀與水相和有機(jī)相的分界線輪廓匹配，從而解釋了為何斑點(diǎn)的朝向不一致。因?yàn)榈綄游龊笃?，層析速度慢的氨基酸只能停留在水相與有機(jī)相的交界處。5、實(shí)驗(yàn)總結(jié)與改進(jìn)：1）在做紙層析時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格保證展層劑各組分的比例，因?yàn)?值與展層劑的組成密切相關(guān)，且比例不對(duì)時(shí)還可能引起展層劑分層，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2）將紙筒放入層析缸時(shí)一定要小心放平，否則層析方向會(huì)偏，后續(xù)測(cè)量層析點(diǎn)到原點(diǎn)的距離時(shí)容易產(chǎn)生誤差。3）實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要避免用手直接接觸濾紙，也不要將濾紙隨意放置