pro測(cè)定方法分為兩大類

1、蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測(cè)定蛋白質(zhì)含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。但是食品種類很多，食品中蛋白質(zhì)含量又不同， 特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此蛋白質(zhì)的 測(cè)定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收，用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。由于食品中蛋白質(zhì)含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣 的。一 凱氏定氮法這種方法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當(dāng)時(shí)凱氏只使用 H2SO4來分解試樣，來定量谷物

2、中的蛋 白質(zhì)，他只知用 H2SO4分解試樣，而不能闡明 H2SO4分解有機(jī)氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程， 所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長(zhǎng)時(shí)間，后來由Gunning加入改進(jìn)，他改進(jìn)的辦法是在 消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升，這樣加快分解速度，因?yàn)闇囟扔稍瓉砹蛩岱悬c(diǎn)的 380上升到 400C，提高了不到67C所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。我們?cè)跈z驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)時(shí)，往往只限于測(cè)定總氮量， 然后乘以蛋白質(zhì)核算等數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱 為粗蛋白質(zhì)。1凱氏常量定氮法：不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，

3、首先第一個(gè)步驟是消化：(1) 消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物，使有機(jī)物中的C H氧化為C02和H2O蒸汽逸出，而蛋白質(zhì)則分解氮，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性 溶液中。(2) 在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330C，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá) 400C，加速了整個(gè)反應(yīng)過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過程硫 酸的不斷地被分解， 水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨而

4、造成損失。為了加速反應(yīng)過程， 還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示 劑。(1) 蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液 要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。(2) 吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定， 硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色

5、反應(yīng)，它有吸收氨的作用。1操作步驟:準(zhǔn)確稱取樣品中 0.50- 2.00gt于500ml凱氏瓶中宀加 10g無水K2S04加0.5gCuSO4加20ml H2SO4在通風(fēng)櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后， 將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中t繼續(xù)消化30分鐘t至到樣液呈綠色狀態(tài)，停止消化，冷卻t加200ml水t連接蒸餾裝置t用硼酸作吸收液t在K氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50% NaOT立即接好定氮球t加熱t(yī)至到K氏瓶?jī)?nèi)殘液減少到三分之一時(shí)，取出用水沖洗t用0.1N HCl滴定。N ( V2-V1) 0.014W計(jì)算：總氮量 %=( N(V2- V1) X 0.01

6、4 ) /W X 1000.014-氮的毫克當(dāng)量數(shù)蛋白質(zhì)=總氮%XK乳制品 K=6.38 ( N=15.7%)小麥粉 K=5.79 ( N=17.6%)動(dòng)物膠 K=5.6 (N=18.0%)冰蛋 K=6.7 (N=14.8%)大豆制品K=6.0 (16.7%)K=6.25 則(N=16%K-換稱等數(shù)各種試劑的作用：濃 H2SO4A :脫水使有機(jī)物炭化，然后有機(jī)物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2本身則變?yōu)?CO2B:氧化C:蛋白質(zhì)與濃 H2SO4生成 NH3T, CO2 SO2, H2OTD: NH3與H2SO4生成硫酸銨(1) CuSO4的作用(催化劑)CuSO4為紅色沉淀，當(dāng)C完全消化

7、后，反應(yīng)停止，紅色消失，變?yōu)樘m色，即為消化達(dá)到完全，蘭色為CuSO4的顏色(2) K2SO4的作用(提高沸點(diǎn))沸點(diǎn)由330C提高到400C加速了反應(yīng)過程。(3 )硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常采用硫酸銅(4) 50%NaO的作用下面我就針對(duì)幾點(diǎn)來說明為何影響氨化完全和速度快的因素：(1) K氏燒瓶和取樣量如果稱1g以上的樣品，就需要 K氏燒瓶最小500ml, 8001000ml的更好，這樣的 K氏燒瓶 對(duì)于縮短氨化時(shí)間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。(2) 分解劑AH2SO4和K2SO4的添加量有機(jī)無分解需要H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同，如

8、果試樣含脂類 高，則加H2SO侈，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4勺添加比例是：1g 樣品K2SO4:H2SO4=7g： 12ml這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的還有一種比例：K2SO4: H2SO4=10 20mlB 催化劑用作催化劑的有 Hg HgO Se,硒化合物，CuSO4 TiO2，對(duì)Hg, HgO有毒但結(jié)果好，Se與CuSO4得到結(jié)果是一種，TiO2，的結(jié)果偏低，采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同，HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55, TiO2消化麥子70,所以在給出測(cè)定結(jié)果時(shí)要注明催 化劑的類型。(

9、3) 熱源的強(qiáng)度K2SO4加得多，如果熱源弱,消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大，即便鹽類也是沒有意義的，熱源過強(qiáng)導(dǎo)致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等，也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。（4 ）氨的蒸餾和吸收及滴定蒸餾有兩種：1 直接蒸餾（裝置簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性好）2 水蒸汽蒸餾蒸餾加NaOH是 50% 加的量為 H2SO4量的4倍，硫酸量為 12ml，貝U NaOH為12X 4=48ml,而且一般高于這個(gè)理論值，即加到5055ml，如果NaOH!加的不夠就變成 H2S H2S是強(qiáng)酸，使顏色變紅。吸收液有：1標(biāo)準(zhǔn)H2SO4用標(biāo)準(zhǔn)堿返滴定，甲醛紅指示劑2硼酸 用HCI

10、進(jìn)行滴定，混合指示劑目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H2SO4這樣可省略了反滴定， H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)， 而硼酸是弱酸，在滴定時(shí)，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3河上可將氨完全吸收，為保險(xiǎn)期間一般用 4%6實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)a. 樣品應(yīng)時(shí)均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)，液體樣要混合均勻。b. 樣品放入K氏燒瓶時(shí)，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。c. 消化時(shí)，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入 30%±氧化氫催化劑23ml,促使氧化。d. 在整個(gè)消化過程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免

11、附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。e. 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時(shí)，要添加硫酸量。f. 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色， 如果沒有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用 0.1%甲醛紅乙醇溶液。g. 氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。h. 向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀無。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。i. 消化劑綠色后繼續(xù)消化 30分鐘即可。2

12、K氏微量定氮儀法3 K氏半微量定氮儀法（2 、3原理一樣）操作方法大同小異，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。N( V2-V1)0.014V10/100計(jì)算總氮%=(N(V2-V1) X 0.014)/(w X 10/100) X 100對(duì)于微量定氮儀法，儀器有了改進(jìn)，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。4 K氏自動(dòng)定氮法原理與上面一樣，儀器， 采用K氏自動(dòng)定氮儀：其裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置，自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置，消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的 K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。二 水揚(yáng)酸比色法：1 原理： 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng) H2SO4消化轉(zhuǎn)化

13、為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，求出樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。2 方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6個(gè)25ml容量瓶編號(hào)0123456分別加空白酸液2ml分別加磷酸鹽緩沖液5ml稀釋至總體體積至 15ml分別加水揚(yáng)酸鈉5ml37C水浴15分加入次氯酸鈉2.5ml37C水浴15分鐘取出試液于660nm下進(jìn)行比色，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2) 樣品處理：準(zhǔn)確稱樣0.201.00g t于K氏瓶中t加15mlH2SO4和5g催化劑宀電爐上加熱到沸騰后宀加大火力消化t直到出現(xiàn)暗綠色時(shí)t搖動(dòng)瓶子tk氏瓶全部消化后t冷卻t加水至250ml容量瓶

14、。(3) 樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取上述消化溶液 10mli于100ml容量瓶中t定容t準(zhǔn)確吸 2ml于25ml容量瓶中宀加5ml磷酸緩沖液t以下操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟相同并以試劑空白微對(duì)照，測(cè)得樣液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其含氮量。（4）計(jì)算CXF含氮 %= x 100W 1000X 1000C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定樣液的含氮量（Ug）F-樣品溶液的稀釋倍數(shù)W-樣品重量（g）蛋白質(zhì)=總氮% K （ K可為6.25，也可查）3注意事項(xiàng)：A當(dāng)天消化液最好當(dāng)天測(cè)定，結(jié)果重現(xiàn)性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。B當(dāng)在PH和試劑適當(dāng)范圍內(nèi)加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關(guān)，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。C這種方法測(cè)定

15、結(jié)果基本與 K氏法一致。4 試劑(1) 氯標(biāo)液：稱經(jīng)110C干燥2h的硫酸銨0.4719g宀于燒瓶中定容 10ml此液1ml相當(dāng)于 I.Omg氮標(biāo)液t使用時(shí)配制成1ml相當(dāng)于2.50Ug氮標(biāo)液。(2) 空白酸液：稱0.50g蔗糖t加15mlH2SO4和5g催化劑t與樣品一樣消化t定容250mT 使用時(shí)吸收此液10mlT加水至100ml為工作液備用。(3) 磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉t加 38g磷酸三鈉t加20g三九石酸鉀鈉t加 400ml 水溶解t過濾t另稱 35gNaOH溶于100ml水中t冷至室溫t緩緩地?cái)嚢杓尤肓姿猁}溶液中t加 入水稀釋至1000ml備用。(4) 水揚(yáng)酸鈉溶液：稱

16、 25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于 200ml水中過濾，加水 稀釋至 500ml(5) 次氯酸鈉溶液：吸 4ml安替富民液，用水稀釋至100ml5 儀器（1）分光光度計(jì)（2 ）恒溫水浴三 紫外分光光度法1原理：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基，在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質(zhì)濃度（38mg/ml）成直線關(guān)系，因此，通過測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的吸光度， 并參照事先用K氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。2 試劑：（1）0.1mol/l 檸檬酸水溶液。（2） 8mol/l脲（NH2 2C0的2NNaOH溶液。脲的2N氫氧化鈉液（3）95%乙醇

17、（4）無水乙醚3 儀器（1）751型的紫外分光光度計(jì)（2）離心機(jī)4 操作方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取樣品200g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每秒鐘30005000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸出上清夜 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個(gè)10ml容量瓶鐘，每個(gè)容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘（如果離心再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測(cè)定其吸光度。（做參比值）以事先用K氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量微橫坐標(biāo)上面的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2

18、）樣品測(cè)定準(zhǔn)確稱取試樣1.00g t于50ml燒杯中t加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml宀攪拌10分鐘宀四層 紗布過濾到離心管中t用 8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn) 曲線上查出蛋白質(zhì)的含量。計(jì)算：蛋白質(zhì)=C/WX100C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（mg）W-測(cè)定樣品溶液相當(dāng)于樣品量（ mg說明：a. 此法運(yùn)用于糕點(diǎn)，牛乳和可溶性蛋白質(zhì)樣品，測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)把表皮顏色去掉。b. 溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在2030C。四 雙縮脲法-皮尼克法1原理：雙縮脲在堿性條件中，能與CuS04吉合成紅紫色的絡(luò)合物。蛋白質(zhì)分子中含有肽鏈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也呈此反應(yīng)。本法直接用于測(cè)定像小麥粉等固體試樣的蛋白質(zhì)含量。