土壤線蟲卵檢查方法

1、土壤線蟲卵檢查方法土壤線蟲卵檢查方法江西省寄生蟲病防治研究所江西省寄生蟲病防治研究所漂浮法原理漂浮法原理先用堿性溶液和已經(jīng)處理過的土壤樣品充先用堿性溶液和已經(jīng)處理過的土壤樣品充分混合，用比重比蟲卵重的溶液把蟲卵漂分混合，用比重比蟲卵重的溶液把蟲卵漂浮到液體表面，從而收集進(jìn)行鏡檢。浮到液體表面，從而收集進(jìn)行鏡檢。幾種漂浮液和蠕蟲卵比重幾種漂浮液和蠕蟲卵比重飽和硝酸鈉溶液飽和硝酸鈉溶液 1.358-1.365飽和硫酸鋅溶液飽和硫酸鋅溶液 1.180飽和鹽水飽和鹽水 1.175-1.200華支睪吸蟲卵華支睪吸蟲卵 1.170-1.190 姜片吸蟲卵姜片吸蟲卵 1.190日本血吸蟲卵日本血吸蟲卵 1.

2、200 鉤蟲卵鉤蟲卵 1.055-1.080鞭蟲卵鞭蟲卵 1.150 蟯蟲卵蟯蟲卵 1.105-1.115受精蛔蟲卵受精蛔蟲卵 1.110-1.130 未受精蛔蟲卵未受精蛔蟲卵 1.210-1.230采樣與處理采樣與處理1、菜田、菜田 取從土表及表層以下取從土表及表層以下2 cm處泥土；處泥土；2、廁所、庭院、廚房取表層土；（無土層或土量不夠，、廁所、庭院、廚房取表層土；（無土層或土量不夠，以鞋底刮取的土樣替代）以鞋底刮取的土樣替代） 3、每份糞樣、每份糞樣50-100 g；4、土樣取回后自然晾干；、土樣取回后自然晾干；5、晾干土樣挑去粗大雜物，壓碎土樣大顆粒；、晾干土樣挑去粗大雜物，壓碎土樣

3、大顆粒；6、收集孔徑、收集孔徑3 mm粗篩后粗篩后2 mm過篩土樣。過篩土樣。方法方法 1 、取土樣、取土樣5g于于15 ml離心管，加離心管，加5 %NaOH溶液至溶液至10-14 ml刻度；刻度；2 、顛倒充分混勻（重復(fù)、顛倒充分混勻（重復(fù)34次，每隔次，每隔10 min），），2000 rpm，4min；3、傾去上部的、傾去上部的NaOH，加入飽和，加入飽和NaNO3攪拌混勻，攪拌混勻，2000 rpm，4min；4 、離心后，再加飽和、離心后，再加飽和NaNO3滿至管口，覆上滿至管口，覆上18mm18 mm蓋蓋玻片；玻片；5、靜置、靜置15 min后，取下蓋玻片置載玻片上鏡檢（每樣做兩

4、管，后，取下蓋玻片置載玻片上鏡檢（每樣做兩管，取平均值為計(jì)數(shù)結(jié)果）；取平均值為計(jì)數(shù)結(jié)果）；6、一份樣品計(jì)數(shù)、一份樣品計(jì)數(shù)34張蓋玻片。張蓋玻片?？讖?mm孔徑3mm過篩土樣5%的NaOH溶液5%的NaOH溶液離心后土樣取5g土樣于15ml離心管內(nèi)，加5%NaON溶液振搖混勻，2000轉(zhuǎn)離心4min飽和硝酸鈉溶液離心后土樣棄NaOH溶液，加飽和硝酸鈉溶液混勻，2000轉(zhuǎn)離心4min靜置15min取下鏡檢飽和硝酸鈉溶液沉淀土樣再加飽和硝酸鈉溶液滿至管口，覆上蓋玻片土 壤土壤線蟲卵生活力測(cè)定土壤線蟲卵生活力測(cè)定法法 在土壤線蟲卵生活力測(cè)定法中，可選用直接鏡檢在土壤線蟲卵生活力測(cè)定法中，可選用直接鏡檢

5、法，染色法和培養(yǎng)法，以直接鏡檢為常用。法，染色法和培養(yǎng)法，以直接鏡檢為常用。 土壤蛔蟲卵直接鏡檢法：土壤蛔蟲卵直接鏡檢法： 是根據(jù)蛔蟲卵在發(fā)育過程中所出現(xiàn)的各種形態(tài)，以鑒別其死是根據(jù)蛔蟲卵在發(fā)育過程中所出現(xiàn)的各種形態(tài)，以鑒別其死活。活。 鑒別受精卵和未受精卵；鑒別受精卵和未受精卵； 鑒別有生活力和失去生活力鑒別有生活力和失去生活力(變性卵變性卵)的受精卵和含有幼蟲的受精卵和含有幼蟲卵的形態(tài)。卵的形態(tài)。土壤蛔蟲卵生活力鑒別要點(diǎn)土壤蛔蟲卵生活力鑒別要點(diǎn)未受精蛔蟲卵形態(tài)未受精蛔蟲卵形態(tài) 多為長(zhǎng)橢圓形，有時(shí)呈不規(guī)則形，大小平均為多為長(zhǎng)橢圓形，有時(shí)呈不規(guī)則形，大小平均為80984060 m，一般為黃褐色

6、，有時(shí)蛋白質(zhì)殼發(fā)育不全，一般為黃褐色，有時(shí)蛋白質(zhì)殼發(fā)育不全，有時(shí)完全失去蛋白質(zhì)殼，卵內(nèi)經(jīng)常充滿大大小小油滴狀的卵有時(shí)完全失去蛋白質(zhì)殼，卵內(nèi)經(jīng)常充滿大大小小油滴狀的卵黃細(xì)胞。黃細(xì)胞。 未脫蛋白膜和脫蛋白膜未受精蛔蟲卵未脫蛋白膜和脫蛋白膜未受精蛔蟲卵 受精蛔蟲卵形態(tài)受精蛔蟲卵形態(tài)活受精蛔蟲卵活受精蛔蟲卵 蛋白質(zhì)殼為黃褐色，脫蛋白質(zhì)殼的為無色透明；平均大小蛋白質(zhì)殼為黃褐色，脫蛋白質(zhì)殼的為無色透明；平均大小為為50704050 m；外層卵殼厚，內(nèi)層薄，有屈光性，最；外層卵殼厚，內(nèi)層薄，有屈光性，最外層蛋白質(zhì)殼也很厚，呈乳狀或花紋狀突起；卵內(nèi)有一個(gè)球外層蛋白質(zhì)殼也很厚，呈乳狀或花紋狀突起；卵內(nèi)有一個(gè)球形

7、的卵細(xì)胞，卵殼兩端和卵細(xì)胞之間，有形的卵細(xì)胞，卵殼兩端和卵細(xì)胞之間，有半月形半月形空隙，卵內(nèi)空隙，卵內(nèi)卵黃顆粒清晰而致密。卵黃顆粒清晰而致密。含有活幼蟲卵含有活幼蟲卵 蟲體的前后部沒有顆粒，中部顆粒清晰而有金屬光澤，有蟲體的前后部沒有顆粒，中部顆粒清晰而有金屬光澤，有立體感，鏡檢時(shí)，注視或輕壓，可見有輕微蠕動(dòng)，強(qiáng)壓后，立體感，鏡檢時(shí)，注視或輕壓，可見有輕微蠕動(dòng)，強(qiáng)壓后，有時(shí)可擠出幼蟲。有時(shí)可擠出幼蟲?；钍芫紫x卵形態(tài)活受精蛔蟲卵形態(tài)未脫蛋白膜未脫蛋白膜 脫蛋白膜脫蛋白膜 含含4個(gè)卵細(xì)胞個(gè)卵細(xì)胞（脫蛋白膜）（脫蛋白膜） 桑椹期桑椹期 （脫蛋白膜）（脫蛋白膜）含幼蟲的活含幼蟲的活受精蛔蟲卵受精蛔蟲

8、卵死受精蛔蟲卵死受精蛔蟲卵(變性卵變性卵) 卵細(xì)胞移向一端，使卵殼兩端呈現(xiàn)有卵細(xì)胞移向一端，使卵殼兩端呈現(xiàn)有大小不等的半月形空隙大小不等的半月形空隙； 卵內(nèi)脂肪變性，卵內(nèi)脂肪變性，形成空泡，形成空泡，很像未受精卵；很像未受精卵； 卵細(xì)胞質(zhì)渾濁，卵細(xì)胞質(zhì)渾濁，呈黑色或棕黑色呈黑色或棕黑色； 卵細(xì)胞向不定部位呈球狀收縮；卵細(xì)胞向不定部位呈球狀收縮； 卵殼的一側(cè)或兩側(cè)，一端或兩端向內(nèi)凹陷或破裂；卵殼的一側(cè)或兩側(cè)，一端或兩端向內(nèi)凹陷或破裂； 卵細(xì)胞顆粒減少或消失卵細(xì)胞顆粒減少或消失; 只有蛋白質(zhì)殼，而缺內(nèi)容物。只有蛋白質(zhì)殼，而缺內(nèi)容物。含死幼蟲蟲卵含死幼蟲蟲卵 幼蟲體內(nèi)幾乎幼蟲體內(nèi)幾乎充滿顆粒充滿顆粒

9、，且模糊不清，無金屬光澤，缺乏立體，且模糊不清，無金屬光澤，缺乏立體 感，鏡檢時(shí)久久不見蠕動(dòng)，稍稍加熱或輕壓，不會(huì)蠕動(dòng)；強(qiáng)壓時(shí)，感，鏡檢時(shí)久久不見蠕動(dòng)，稍稍加熱或輕壓，不會(huì)蠕動(dòng)；強(qiáng)壓時(shí)，雖能擠出幼蟲，但也不改變其原來的卷曲狀態(tài)。雖能擠出幼蟲，但也不改變其原來的卷曲狀態(tài)。死受精蛔蟲卵形態(tài)死受精蛔蟲卵形態(tài)未脫蛋白膜未脫蛋白膜 脂肪變性脂肪變性胞質(zhì)空泡胞質(zhì)空泡 脫蛋白膜脫蛋白膜 含幼蟲死卵含幼蟲死卵 卵細(xì)胞崩解卵細(xì)胞崩解 卵細(xì)胞皺縮卵細(xì)胞皺縮 上部形成空泡上部形成空泡 卵細(xì)胞不規(guī)則裂開卵細(xì)胞不規(guī)則裂開 卵胚變形卵胚變形 卵殼內(nèi)幼蟲變形卵殼內(nèi)幼蟲變形 活受精蛔蟲卵活受精蛔蟲卵卵細(xì)胞崩解的死受精蛔蟲卵卵

10、細(xì)胞崩解的死受精蛔蟲卵空泡化死受精蛔蟲卵空泡化死受精蛔蟲卵含幼蟲的活受精蛔蟲卵含幼蟲的活受精蛔蟲卵含幼蟲的的活受精蛔蟲卵含幼蟲的的活受精蛔蟲卵卵殼內(nèi)幼蟲變形的死受精蛔蟲卵卵殼內(nèi)幼蟲變形的死受精蛔蟲卵內(nèi)含物變形死受精蛔蟲卵內(nèi)含物變形死受精蛔蟲卵活鞭蟲卵活鞭蟲卵含幼蟲的活鞭蟲卵含幼蟲的活鞭蟲卵鞭蟲卵（細(xì)胞質(zhì)形成空泡鞭蟲卵（細(xì)胞質(zhì)形成空泡 ）螨螨 卵卵螨卵螨卵美藍(lán)、伊紅、硼砂染色法鑒別蛔蟲卵死活美藍(lán)、伊紅、硼砂染色法鑒別蛔蟲卵死活1、美藍(lán)、伊紅、硼砂染液（簡(jiǎn)稱、美藍(lán)、伊紅、硼砂染液（簡(jiǎn)稱M.E.B）的配制）的配制 將將0.2 g美藍(lán)加入美藍(lán)加入100 ml蒸餾水中煮沸蒸餾水中煮沸10 min，加入硼

11、，加入硼砂砂0.5g，再煮沸，再煮沸10 min，冷卻后加入伊紅，冷卻后加入伊紅0.1g，待完全溶，待完全溶解后過濾備用。（解后過濾備用。（pH為為1011，在室溫中可放置，在室溫中可放置1.5年）。年）。2、脫蛋白膜、脫蛋白膜 將收集的蛔蟲卵加入將收集的蛔蟲卵加入30 %次氯酸鈉，作用次氯酸鈉，作用1 min，并，并經(jīng)常振蕩，再用蒸餾水洗經(jīng)常振蕩，再用蒸餾水洗 2 次，即可脫掉蛋白膜。次，即可脫掉蛋白膜。3、染色鏡檢、染色鏡檢 蟲卵沉淀物加蟲卵沉淀物加M.E.B染色液各一滴于載玻片上，上覆染色液各一滴于載玻片上，上覆 蓋玻片，靜置蓋玻片，靜置35 min后鏡檢。后鏡檢。 吸取蟲卵沉淀物吸取蟲

12、卵沉淀物1滴放入小試管內(nèi)，加入染色液染滴放入小試管內(nèi)，加入染色液染30 分鐘，再用蒸餾水洗分鐘，再用蒸餾水洗23次，吸取沉淀物鏡檢。次，吸取沉淀物鏡檢。（活蟲卵卵殼、內(nèi)含物不著色，死蟲卵卵殼、內(nèi)含物染成藍(lán)（活蟲卵卵殼、內(nèi)含物不著色，死蟲卵卵殼、內(nèi)含物染成藍(lán)色）色） 土壤鉤蟲卵的檢查土壤鉤蟲卵的檢查蟲卵及幼蟲在體外的發(fā)育蟲卵及幼蟲在體外的發(fā)育 條件條件 溫暖溫暖(25oC30oC)、 濕度濕度(60%80%)、 蔭蔽、氧足的疏松泥土蔭蔽、氧足的疏松泥土 發(fā)育快發(fā)育快 （58天）天） 蟲卵蟲卵24h脫殼脫殼 桿狀蚴桿狀蚴以細(xì)菌及其分以細(xì)菌及其分解有機(jī)物為食解有機(jī)物為食 58天蛻皮兩次天蛻皮兩次 絲

13、狀蚴絲狀蚴感染期感染期1、取表層、取表層 23 cm土樣，在土樣，在 500 ml塑料燒杯中定量至塑料燒杯中定量至 300 ml刻度（約刻度（約 300 g表層土）后放入保鮮袋，注明土樣編號(hào)，表層土）后放入保鮮袋，注明土樣編號(hào)，在記錄本注明取樣點(diǎn)、種植物類型、戶主姓名、采樣份數(shù)在記錄本注明取樣點(diǎn)、種植物類型、戶主姓名、采樣份數(shù)等基本信息。等基本信息。2、分樣篩（、分樣篩（20目，直徑目，直徑 20 cm）篩網(wǎng)面上鋪上）篩網(wǎng)面上鋪上2層棉紙層棉紙（棉紙直徑（棉紙直徑 28 cm），隨后倒入樣本土，用大鑷子將顆粒），隨后倒入樣本土，用大鑷子將顆粒較大的土塊壓細(xì)后將土鋪展均勻。較大的土塊壓細(xì)后將土鋪

14、展均勻。土壤鉤蚴分離方法土壤鉤蚴分離方法3、將鋪好的分樣篩放入搪瓷盤（或不銹鋼臉盆）中，加入、將鋪好的分樣篩放入搪瓷盤（或不銹鋼臉盆）中，加入45的自來水，至水的液面稍沒過篩網(wǎng)面的棉紙為止。的自來水，至水的液面稍沒過篩網(wǎng)面的棉紙為止。4、將搪瓷盤（或不銹鋼臉盆）放入水浴箱（或溫箱）中，、將搪瓷盤（或不銹鋼臉盆）放入水浴箱（或溫箱）中，水溫控制在水溫控制在 45左右，放置左右，放置1.5小時(shí)。小時(shí)。5、取出分樣篩，將搪瓷盤（或不銹鋼臉盆）中的水倒入三、取出分樣篩，將搪瓷盤（或不銹鋼臉盆）中的水倒入三角量杯（燒杯）中進(jìn)行自然沉淀半小時(shí)。角量杯（燒杯）中進(jìn)行自然沉淀半小時(shí)。6、緩緩棄去上清，留底部、

15、緩緩棄去上清，留底部 50 ml或更少的液體，于平皿中解或更少的液體，于平皿中解剖鏡鏡檢，進(jìn)行十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲鉤蚴的鑒別和計(jì)剖鏡鏡檢，進(jìn)行十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲鉤蚴的鑒別和計(jì)數(shù)。數(shù)。鉤蚴分離注意事項(xiàng)鉤蚴分離注意事項(xiàng)1、土樣應(yīng)在早上、土樣應(yīng)在早上10點(diǎn)前采集完畢；點(diǎn)前采集完畢；2.、采集的土樣在近一段時(shí)間內(nèi)沒有噴過殺蟲劑；、采集的土樣在近一段時(shí)間內(nèi)沒有噴過殺蟲劑；3、若分離后水太渾濁，可進(jìn)行水洗和半小時(shí)沉淀的步驟，、若分離后水太渾濁，可進(jìn)行水洗和半小時(shí)沉淀的步驟，重復(fù)多次。重復(fù)多次。兩種鉤蟲絲狀蚴的鑒別要點(diǎn)兩種鉤蟲絲狀蚴的鑒別要點(diǎn)鑒別要點(diǎn)美洲鉤蟲 十二指腸鉤蟲外形長(zhǎng)紡錘形，蟲體較短粗，頭端略圓，尾端較尖，體長(zhǎng)0.56 mm圓柱形，蟲體細(xì)長(zhǎng)，頭端略扁平，尾端較鈍，體長(zhǎng)0.66 mm鞘橫紋顯著(高倍鏡下)不顯著(高倍鏡下)食管矛黑色桿狀，前端稍分叉，兩矛粗細(xì)相等，兩矛間距窄(低倍鏡下)透明絲狀，背矛較粗，兩矛間距寬(低倍鏡下)腸管管腔較寬，為體寬的3/5，腸細(xì)胞顆粒少管腔較窄，為體寬的1/2，腸細(xì)胞顆粒豐富美洲鉤蟲美洲鉤蟲鉤蟲絲狀蚴的鑒別鉤蟲絲狀蚴的