丹參酮ⅡA磺酸對AngⅡ誘導(dǎo)心房成纖維細(xì)胞膠原合成及TGF—β活化

1、描述：目的：觀察丹參酮H A磺酸鈉(sodium tanshinone n A sulfonate , STS)對血管緊張素H (angiotensinn, Ang n)誘導(dǎo)心房成纖維細(xì)胞膠原合成及TGF- Bl活化表1 STS對膠原含量的影響(無士川心5)fable 1 Effect oF STS collagen content (x s j組別/jxmol L-1軽脯氨酸/對照19.25 :Ang 11 0. 131.78 :Ang JI 0. 1 4- STS 329. 96 ：Ang 11 0. 1 +STS 1026.55 -A rig U 0. 1 + STS 3022. 56

2、：注:與對照組相比，)P0.01;與Angfl組相比$0.0125000 對照 Angll 310AngH+STSA 與對照組相比1P0.01；與Ang 11組相比2)P 2,3 同)。圖1 STS對AFs膠原合成速率的影響G Fig. 1 Effect of STS on collagen synthesis%/字 ULDH$I艇Ang II +STS/|imo 圖2 STS對活性TGF及總TGF仔令 n =5)Fig. 2 Effect of STS on the levels of A-TC(xsji- 5)摘要目的：觀察丹參酮n A磺酸鈉(sodium tanshinone n A s

3、ulfonate , STS)對血管緊張素( an giote nsin n, Ang n)誘導(dǎo)心房成纖維細(xì)胞膠原合成及 TGF- Bl活化的影 響。方法：培養(yǎng)新生大鼠心房成纖維細(xì)胞，檢測膠原含量，并3H-脯氨酸摻入法測定膠原合成速率作為心肌纖維化指標(biāo)。ELISA法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中活性TGF- B1及總TGF- 1含量。發(fā)表論文網(wǎng) Western blot測定血小板反應(yīng)素-1 （ thrombospondin-1 ，TSP-1）表達(dá)。 結(jié)果：Ang n能夠明顯上調(diào)心房成纖維細(xì)胞膠原含量、膠原合成速率；TSP-1表達(dá)及活性TGF- B1分泌量上調(diào)，而總TGF- B1表達(dá)無明顯改變。 在STS處

4、理后，除總TGF- 1外，其他 指標(biāo)均明顯下調(diào)。結(jié)論：STS能減輕Ang n誘導(dǎo)心房成纖維細(xì)胞膠原分泌及合成速率，機制與抑制TSP-1/TGF- B1通路有關(guān)。心房顫動（房顫）為臨床最常見的快速性心律失常，嚴(yán)重危害人類健康，可致心功能不全及腦栓塞等并發(fā)癥，明顯增加患者死亡率。新近研究提示在多種因素所致房顫模型，均可見顯著的心房纖維化（atrial fibrosis ），后者干擾局部激動傳導(dǎo)，造成單向傳導(dǎo)阻滯，增加 沖動不均一性和碎裂電活動，促進(jìn)房顫維持。因此，心房纖維化是房顫維持的關(guān)鍵因素，嚴(yán)重?fù)p害心功能2。尋找治療心房纖維化的治療方法是改善房顫患者愈后的新途徑。研究表明血管緊張素n（ ang

5、iotensin n, Ang n）是心房纖維化發(fā)病機制中重要的一環(huán)，可通過血小板反應(yīng)素 -1 （thrombospondin 1 , TSP-1） /轉(zhuǎn)化生長因子-3 1 （ TGF- 3 1途徑誘導(dǎo)心肌重構(gòu)3-4。我國傳統(tǒng)中藥丹參臨床上主要用于冠心病的治療，本室也發(fā)現(xiàn)其能抑制心肌重構(gòu)，但其對心房纖維化研究尚少。本實驗利用培養(yǎng)的新生大鼠心房成纖維細(xì)胞，研究丹參的主要成分丹參酮nA衍生物 丹參酮n A磺酸鈉” （sodium tanshinonen Asulfonate , STS）對Ang n誘導(dǎo)的膠原分泌及合成速率，TSP-1/TGF- 3 1通路的影響，探討STS抗MF的可能機制，為其在

6、臨床用于防治心房纖維化提供實驗依據(jù)。1材料1.1動物12 d齡新生 Wistar大鼠，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK （鄂）2004-0007。1.2試劑與儀器 Ang n（ Sigma公司）；STS （中國食品藥品檢定研究院，批號 S02001300 ）; DMEM干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、3H-脯氨酸（中國科學(xué)院上海原子能研究所）；PMSF和leupeptin （Sigma公司）；PVDF膜（Amersham 公司）；羥脯氨酸試劑盒及 TGF- 3 1 ELISA試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；小鼠抗大鼠 TSP-1（Santa Cruz公司）；其余試劑為國產(chǎn)

7、分析純。LS3810液體閃爍儀（Beckman公司），垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Biorad公司）。2方法2.1新生大鼠心房成纖維細(xì)胞（ atrial fibroblasts , AFs）培養(yǎng) 取12 d齡的 Wistar大鼠，在無菌條件下開胸剪取心室肌，無菌條件下剪碎心肌，0.1%膠原酶消化液消化后，加入含10胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸 液，調(diào)整細(xì)胞密度為1X105個/mL ,根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁1 h,去除心肌細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至近融合狀態(tài)時按1 : 2傳代。傳代后成纖維細(xì)胞用抗波形蛋白( Vimentin )單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定

8、，純度達(dá)到 95%。實驗用第35代的細(xì)胞。2.2分組 共分為5組，分別為對照組，給予生理鹽水； Ang n( 0.1卩mol !)組; Ang n (0.1 卩 mol-1)+STS( 3 卩 mol -t)組；Ang n ( 0.1 卩 mol-1)+STS (10 卩 mol -1) 組； Ang n( 0.1 卩 mol -1) +STS ( 30 卩 mol -H )組。2.3羥脯氨酸法測定膠原蛋白含量各干預(yù)因素處理細(xì)胞 48 h后，取細(xì)胞上清液0.5 mL ,加無水乙醇1.2 mL ,旋渦混勻器充分混勻2 min , 2次，3 500 r min-1離 心10 min，取上清(約1.

9、5 mL )，烘干，力口 0.5 mL雙蒸水復(fù)溶，制成稀釋倍數(shù)為1的檢測液，加試劑1,2, 3 (具體見試劑盒說明書)，混勻， 65 C水浴15 min，冷卻后，在550 nm波長比色。 膠原蛋白含量=7.46 X羥脯氨酸含量(羥脯氨酸含量占膠原的13.4% )。羥脯氨酸=(A測定管-A空白管)/ (A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)X標(biāo)準(zhǔn)管濃度X稀釋倍數(shù)。2.4膠原合成(3H-proline 摻入率)的測定 AFs接種到24孔培養(yǎng)板，貼壁生長至匯 合狀態(tài)后，更換無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使AFs處于G0/GI期。更換新的培養(yǎng)液(含0.4%FCS-DMEM及0.3 mmol L-1抗壞血酸)，加入上述

10、各組干預(yù)，同時每孔加入37 X106Bq L-1的3H-proline ,共育30 h后，0.25%的胰酶消化并收集細(xì)胞。在0.22的醋酸纖維素微孔濾膜上負(fù)壓抽濾，生理鹽水和10%的三氯乙酸沖洗濾膜，95%乙醇脫色，烘干后置入閃爍瓶中，加入二甲苯閃爍液 4 mL,靜置過夜后，在液體閃爍儀計數(shù)器(Tri-carb2300 , 美國Packard公司)上進(jìn)行放射性強度的測定。2.5 ELISA法測定活性TGF- 1及總TGF- 1含量 按TGF- B1免疫檢測試劑盒說明書分 別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中活性TGF- B1及總TGF- 3 1含量。總TGF- B1檢測樣本需經(jīng)1 mol L-1鹽酸化處理；活

11、性 TGF- 31檢測采用非鹽酸化處理的上清液。各組所得結(jié)果與對照組進(jìn)行對 比，進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.6總蛋白的提取 取5X105個各組干預(yù)后的心房成纖維細(xì)胞，加入5倍體積的裂解液孵育 20 min，其組成為：Tris-HCl 50 mmol L-1 pH 8.0 , NaCl 150 mmol - L-1 , EDTA 0.5 mmol L-1 , DTT 1 mmol L-1 ,NP-40 1%，脫氧膽酸鈉 0.5% , SDS 0.1%，釩酸鈉 100卩 mol -1) PMSF 100 mg L-1 , apmtinin 1 mg L-1, leupeptin 2 mg L-1，冰浴條件下

12、進(jìn)行 組織勻漿，4 C, 12 000 r min-1離心10 min，取上清，用Folin酚法進(jìn)行蛋白定量后保存 于-70 C。2.7免疫印跡法檢測 TSP-1蛋白表達(dá) 取40速總蛋白加入上樣緩沖液煮沸3 min變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后與I ： 1 000稀釋的TSP-1一抗4 C孵育過夜，與1 : 1萬稀釋的二抗室溫孵育I h，再與化學(xué)發(fā)光試劑 ECL溫浴I min后曝光、顯影和定影，對結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描。用目標(biāo)蛋白表達(dá)量的灰度值除以內(nèi)參表達(dá)量 的灰度值，以所得的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。2.8統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用AKx-Ds表示，用

13、SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行單 因素方差分析，以 P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1 STS對AFs膠原含量的影響 0.1卩mol -Lng n能顯著提高羥脯氨酸含量（P0.01 ）。3,10,30卩mol -HSTS處理后，羥脯氨酸含量明顯減少（P0.01 ），見表1。3.2 STS對AFs膠原合成速率（3H-proline 摻入率）的影響 0.1卩mol -1Ang n作用24 h后，AFs膠原合成速率較對照組增加至（175.88 9.22 ） % （ P0.01 ），而3 , 10,30卩mol-1-SLS處理后能顯著抑制 Ang n誘導(dǎo)的AFs膠原合成速率的增加（P0.0

14、1 ），見 圖1。XC楊樂-1.TIF與對照組相比 1） P0.01 ;與Ang n組相比2） P0.05 , 3） P0.01 （圖2, 3同）。圖1 STS對AFs膠原合成速率的影響（土s, n=5 ）3.3 STS對活性TGF- Bl及總TGF- Bl含量的影響 新近研究表明，循環(huán)或局部Ang n主要通過活化TGF- B1而促心房纖維化。因此，為進(jìn)一步探討STS抑制Ang n誘導(dǎo)心房成纖維細(xì)胞膠原含量及膠原合成速率增加的機制，用 ELISA法檢測各組活性 TGF- A-TGF- Bl及總TGF- Bl （T-TGF- B）含量，數(shù)據(jù)顯示 Ang n明顯上調(diào) A-TGF- Bl表達(dá)（P0.

15、01 ），而 對T-TGF- Bl表達(dá)無明顯影響，結(jié)果與以往報道一致3。STS干預(yù)后，A-TGF- Bl表達(dá)明顯下調(diào)（P0.01 ），見圖2。3.4 STS對TSP-1蛋白表達(dá)的影響 研究表明，Ang n誘導(dǎo)TGF- Bl活化的關(guān)鍵因素是血 小板反應(yīng)素-1 （TSP-1 ）。為證實STS抑制Ang n誘導(dǎo)TGF- Bl活化的機制，用免疫印跡法 檢測各組TSP-1蛋白表達(dá)， 數(shù)據(jù)顯示TSP-1表達(dá)被STS顯著抑制（P0.01 ），見圖3。4討論心房顫動（房顫）的發(fā)生源于心臟電生理改變和心房結(jié)構(gòu)重塑的共同作用。心房纖維化會引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積與降解失衡，以及成纖維細(xì)胞的過度增殖等。早期研究顯示心室纖

16、維化會引起心室壁進(jìn)行性硬化，進(jìn)而引起心室功能不全和充血性心力衰竭。但隨后的研究突出顯示了心房纖維化與房顫的關(guān)系，與瓣膜病、高血壓和老齡化的關(guān)系。調(diào)控心房纖維化也成為臨床上治療房顫患者的重要途徑7。然而目前用中草藥干預(yù)這一過程的研究尚少。我國傳統(tǒng)中藥丹參具有抗缺血缺氧、改善微循環(huán)、抑制血小板黏附聚集功能和抗血栓形成作用，臨床上主要用于冠心病的治療。但其對心肌纖維化的作用報道較少。本實驗用培養(yǎng)的新生大鼠心房成纖維細(xì)胞研究丹參的主要成分丹參酮nA衍生物STS對Ang n誘導(dǎo)心房成纖維細(xì)胞膠原合成的影響，發(fā)現(xiàn)STS能顯著降低Ang n誘導(dǎo)的膠原含量及合成合成速率上升，但機制尚未完全明了。研究證明，在心

17、房成纖維細(xì)胞，Ang n主要通過上調(diào)一些促纖維化的生長因子，間接促進(jìn)纖維化，其中最重要是TGF- 3 1 TGF- Bl分為活性和非活性 2種形式存在，而真正行使促 纖維化效應(yīng)的是活性 TGF- 31。本研究表明，Ang n能上調(diào)活性 TGF- 3 1水平而對總TGF- 31 水平?jīng)]有明顯影響， 這也與既往研究結(jié)果相似，而STS處理后能夠明顯下調(diào)活性TGF- 3。水平，說明STS正是通過抑制 Ang n誘導(dǎo)的TGF- 31活化而降低膠原合成 的。血小板反應(yīng)素-1 (TSP-1)也稱凝血酶敏感素-1，是一個相對分子質(zhì)量為450 kD的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于血小板a顆粒內(nèi)，隨后被證明可由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。研究表明