第13章-流失細(xì)胞術(shù)

1、第十三章第十三章 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是對(duì)細(xì)胞或細(xì)是對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞顆粒進(jìn)行定量分析和細(xì)胞分類研究的技術(shù)。胞顆粒進(jìn)行定量分析和細(xì)胞分類研究的技術(shù)。流式細(xì)胞儀又流式細(xì)胞儀又稱為熒光激活細(xì)胞分類器，稱為熒光激活細(xì)胞分類器，是流體噴射術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、是流體噴射術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和顯微熒光光度術(shù)相結(jié)合的高科技產(chǎn)品。應(yīng)電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和顯微熒光光度術(shù)相結(jié)合的高科技產(chǎn)品。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)單細(xì)胞逐個(gè)地進(jìn)行高速準(zhǔn)確的定量分析和用流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)單細(xì)胞逐個(gè)地進(jìn)行高速準(zhǔn)確的定量分析和分類，每秒測(cè)定達(dá)數(shù)千到數(shù)萬個(gè)細(xì)胞，且有高度的重復(fù)性。分類，

2、每秒測(cè)定達(dá)數(shù)千到數(shù)萬個(gè)細(xì)胞，且有高度的重復(fù)性。這種高速信息的測(cè)量分析和高純度分類的新技術(shù)，為細(xì)胞生這種高速信息的測(cè)量分析和高純度分類的新技術(shù)，為細(xì)胞生物學(xué)提供了一種強(qiáng)有力的研究手段。物學(xué)提供了一種強(qiáng)有力的研究手段。 第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理 一、流式細(xì)胞儀的主要組件一、流式細(xì)胞儀的主要組件 1液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 包括包括各種管道、壓力調(diào)節(jié)開關(guān)、液體各種管道、壓力調(diào)節(jié)開關(guān)、液體流動(dòng)室和超聲振蕩器噴嘴。流動(dòng)室和超聲振蕩器噴嘴。單個(gè)細(xì)胞懸液在狹窄的管道單個(gè)細(xì)胞懸液在狹窄的管道中流動(dòng)，由于細(xì)胞受流體力學(xué)的作用，極易形成貼邊、中流動(dòng)，由于細(xì)胞受流體力學(xué)的作用，極易形成貼邊、堆積堆積,從而造成阻塞。為

3、克服此種現(xiàn)象，利用流體聚焦的從而造成阻塞。為克服此種現(xiàn)象，利用流體聚焦的原理，在不同的壓力作用下使鞘液（通常用原理，在不同的壓力作用下使鞘液（通常用PBS）和細(xì)和細(xì)胞懸液在噴嘴內(nèi)形成層流液束，通過細(xì)胞測(cè)量區(qū)。胞懸液在噴嘴內(nèi)形成層流液束，通過細(xì)胞測(cè)量區(qū)。 2光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)包括光學(xué)系統(tǒng)包括激發(fā)光源、各種光學(xué)濾片激發(fā)光源、各種光學(xué)濾片和各種光信號(hào)探測(cè)器和各種光信號(hào)探測(cè)器。激光光源通常是采用激光器或汞燈等。激光光源通常是采用激光器或汞燈等。激發(fā)光束激發(fā)細(xì)胞所攜帶的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，通過光電轉(zhuǎn)激發(fā)光束激發(fā)細(xì)胞所攜帶的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，通過光電轉(zhuǎn)換器和光電倍增管把微弱的信號(hào)變成電的信號(hào)，光信號(hào)

4、通過換器和光電倍增管把微弱的信號(hào)變成電的信號(hào)，光信號(hào)通過不同的濾片把不同波長的光信號(hào)分開，把干擾光濾掉。不同的濾片把不同波長的光信號(hào)分開，把干擾光濾掉。 3電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 電子系統(tǒng)包括各種電子系統(tǒng)包括各種放大器、模數(shù)轉(zhuǎn)換電放大器、模數(shù)轉(zhuǎn)換電路、高壓電源和各種分析處理輔助系路、高壓電源和各種分析處理輔助系統(tǒng)，還包括把不同細(xì)胞統(tǒng)，還包括把不同細(xì)胞分離開來的邏輯控制系統(tǒng)。分離開來的邏輯控制系統(tǒng)。 4計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 把從細(xì)胞獲取的數(shù)據(jù)記錄儲(chǔ)存起來，把從細(xì)胞獲取的數(shù)據(jù)記錄儲(chǔ)存起來，利用各種不同的軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析加工處理，把結(jié)果以圖、利用各種不同的軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析加工處理，把結(jié)果以圖、表的形式

5、輸出。表的形式輸出。 二、流式細(xì)胞儀的工作原理二、流式細(xì)胞儀的工作原理 流式細(xì)胞儀要求流式細(xì)胞儀要求被檢細(xì)胞用熒光染料染色，呈懸浮被檢細(xì)胞用熒光染料染色，呈懸浮狀態(tài)。狀態(tài)。經(jīng)染色的細(xì)胞通過樣品進(jìn)入管被壓進(jìn)超聲波振蕩經(jīng)染色的細(xì)胞通過樣品進(jìn)入管被壓進(jìn)超聲波振蕩器噴嘴的中央部，同時(shí)將無細(xì)胞的液體經(jīng)過另一進(jìn)入管器噴嘴的中央部，同時(shí)將無細(xì)胞的液體經(jīng)過另一進(jìn)入管壓入噴嘴，使之形成包圍細(xì)胞懸液的鞘液（圖壓入噴嘴，使之形成包圍細(xì)胞懸液的鞘液（圖13-1）。）。在鞘液和細(xì)胞懸液存在一定壓力差的情況下，中央的細(xì)在鞘液和細(xì)胞懸液存在一定壓力差的情況下，中央的細(xì)胞懸液和周圍鞘液的分層液流快速通過胞懸液和周圍鞘液的分層

6、液流快速通過50m的噴嘴圓孔，的噴嘴圓孔，被噴射出來。當(dāng)同軸流動(dòng)的細(xì)胞懸液和鞘液通過激光器被噴射出來。當(dāng)同軸流動(dòng)的細(xì)胞懸液和鞘液通過激光器發(fā)出的氬離子激光束照射小區(qū)時(shí)，發(fā)出的氬離子激光束照射小區(qū)時(shí)，單行流動(dòng)單行流動(dòng)的細(xì)胞發(fā)射的細(xì)胞發(fā)射出熒光，出熒光，熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器接受聚焦后的熒光信號(hào)。接受聚焦后的熒光信號(hào)。 多數(shù)流式細(xì)胞儀可以同時(shí)收集兩種以上不同波長多數(shù)流式細(xì)胞儀可以同時(shí)收集兩種以上不同波長的熒光信號(hào)，檢測(cè)細(xì)胞膜表面或細(xì)胞內(nèi)熒光分子的數(shù)量。的熒光信號(hào)，檢測(cè)細(xì)胞膜表面或細(xì)胞內(nèi)熒光分子的數(shù)量。散射光檢測(cè)器散射光檢測(cè)器則接受細(xì)胞散射偏轉(zhuǎn)后的則接受細(xì)胞散射偏轉(zhuǎn)后的激光束信號(hào)激光束信號(hào)，此此信號(hào)可

7、反映細(xì)胞的物理化學(xué)特性、大小、數(shù)量和類型信號(hào)可反映細(xì)胞的物理化學(xué)特性、大小、數(shù)量和類型。 前向角散射強(qiáng)度信號(hào)與細(xì)胞的大小有關(guān)。散射光強(qiáng)度信前向角散射強(qiáng)度信號(hào)與細(xì)胞的大小有關(guān)。散射光強(qiáng)度信號(hào)則反映細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即流式細(xì)胞儀可以同時(shí)收集兩號(hào)則反映細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即流式細(xì)胞儀可以同時(shí)收集兩個(gè)方向散射光的信號(hào)。兩種光檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)，經(jīng)個(gè)方向散射光的信號(hào)。兩種光檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)，經(jīng)過電子系統(tǒng)的處理，產(chǎn)生脈沖，并使測(cè)量過的細(xì)胞在形過電子系統(tǒng)的處理，產(chǎn)生脈沖，并使測(cè)量過的細(xì)胞在形成微滴時(shí)，帶上不同的電荷（充電）。成微滴時(shí)，帶上不同的電荷（充電）。 當(dāng)充電微滴通過帶有恒定靜電壓的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，帶正當(dāng)充電微滴通

8、過帶有恒定靜電壓的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，帶正電荷的細(xì)胞微滴在靜電場(chǎng)作用下落入左方的細(xì)胞收集器，電荷的細(xì)胞微滴在靜電場(chǎng)作用下落入左方的細(xì)胞收集器，而帶負(fù)電荷的細(xì)胞微滴落入右方的細(xì)胞收集器，不帶電而帶負(fù)電荷的細(xì)胞微滴落入右方的細(xì)胞收集器，不帶電荷的細(xì)胞微滴落入中央的容器中，荷的細(xì)胞微滴落入中央的容器中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選的目的。目的。這種分類技術(shù)能以每秒高達(dá)這種分類技術(shù)能以每秒高達(dá)500010000個(gè)細(xì)胞的個(gè)細(xì)胞的速度分類細(xì)胞，純度在速度分類細(xì)胞，純度在90%99%之間，細(xì)胞活性在通過之間，細(xì)胞活性在通過儀器過程中不受影響。儀器過程中不受影響。流式細(xì)胞儀僅對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行分流式細(xì)胞儀僅對(duì)懸浮細(xì)胞

9、進(jìn)行分析和測(cè)量，析和測(cè)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但無法得到細(xì)胞的形態(tài)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但無法得到細(xì)胞的形態(tài)學(xué)以及多種動(dòng)力學(xué)功能參數(shù)，尤其不能滿足細(xì)胞的解剖學(xué)以及多種動(dòng)力學(xué)功能參數(shù)，尤其不能滿足細(xì)胞的解剖定位研究。定位研究。第二節(jié)第二節(jié) 單細(xì)胞懸液的制備單細(xì)胞懸液的制備 流式細(xì)胞術(shù)所得結(jié)果好壞首先取決于細(xì)胞樣品處理流式細(xì)胞術(shù)所得結(jié)果好壞首先取決于細(xì)胞樣品處理制備方法的優(yōu)劣。所以，要保證細(xì)胞在制備過程中和儲(chǔ)存制備方法的優(yōu)劣。所以，要保證細(xì)胞在制備過程中和儲(chǔ)存期間細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的成分不被破壞和去失，特別是期間細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的成分不被破壞和去失，特別是要分析的那些成分。要分析的那些成分。 一、單層

10、細(xì)胞培養(yǎng)一、單層細(xì)胞培養(yǎng) 使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)，單層生長的細(xì)胞容易分離。單層使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)，單層生長的細(xì)胞容易分離。單層細(xì)胞用細(xì)胞用PBS或或Hanks平衡液加平衡液加0.25% Trypsin洗，當(dāng)細(xì)胞洗，當(dāng)細(xì)胞變圓時(shí)（在倒置顯微鏡下觀察），倒出變圓時(shí)（在倒置顯微鏡下觀察），倒出Trypsin液體后用液體后用手拍打振動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落，然后加入緩沖液搖動(dòng)培養(yǎng)手拍打振動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落，然后加入緩沖液搖動(dòng)培養(yǎng)瓶并用細(xì)管取出含有細(xì)胞的上清液。瓶并用細(xì)管取出含有細(xì)胞的上清液。 二、組織二、組織 從新鮮組織制備單個(gè)細(xì)胞懸液，有的比較容易，例從新鮮組織制備單個(gè)細(xì)胞懸液，有的比較容易，例如淋巴結(jié)組織用注射

11、器反復(fù)抽吸幾次即可得到足夠量的如淋巴結(jié)組織用注射器反復(fù)抽吸幾次即可得到足夠量的細(xì)胞；有的就比較困難，常要用機(jī)械分散和酶消化相結(jié)細(xì)胞；有的就比較困難，常要用機(jī)械分散和酶消化相結(jié)合的方法處理，如肝、睪丸用酶消化處理很容易得到單合的方法處理，如肝、睪丸用酶消化處理很容易得到單個(gè)細(xì)胞。但睪丸生殖細(xì)胞胞質(zhì)之間橋接引起相鄰細(xì)胞溶個(gè)細(xì)胞。但睪丸生殖細(xì)胞胞質(zhì)之間橋接引起相鄰細(xì)胞溶解，形成人為的稱為合胞體的多核假象。很難與解，形成人為的稱為合胞體的多核假象。很難與DNA含含量和體積上相似的單個(gè)細(xì)胞區(qū)分開。神經(jīng)細(xì)胞的處理參量和體積上相似的單個(gè)細(xì)胞區(qū)分開。神經(jīng)細(xì)胞的處理參見細(xì)胞培養(yǎng)。見細(xì)胞培養(yǎng)。 三、血細(xì)胞制備方法

12、三、血細(xì)胞制備方法 （一）全血溶解技術(shù)（一）全血溶解技術(shù) 通過選擇性的溶解紅細(xì)胞，獲得外周血中單個(gè)核細(xì)胞通過選擇性的溶解紅細(xì)胞，獲得外周血中單個(gè)核細(xì)胞和多形核細(xì)胞。和多形核細(xì)胞。 1試劑試劑 氯化銨溶解緩沖液氯化銨溶解緩沖液pH7.3。細(xì)胞洗滌緩沖液：細(xì)胞洗滌緩沖液：不含鈣鎂的不含鈣鎂的Hanks平衡鹽液或平衡鹽液或1PBS緩沖液。緩沖液。 2方法方法 （1）取）取0.51ml用肝素或用肝素或EDTA抗疑的外周血，加入抗疑的外周血，加入15ml離心管內(nèi)，加離心管內(nèi)，加20倍于血體積的氯化銨溶液混勻，室溫倍于血體積的氯化銨溶液混勻，室溫下溶解下溶解8l0min（紅細(xì)胞完全溶解應(yīng)為透明紅色）。紅細(xì)

13、胞完全溶解應(yīng)為透明紅色）。 （2）180g離心離心5min，小心吸出上清，然后把沉淀的小心吸出上清，然后把沉淀的白細(xì)胞用細(xì)胞洗滌緩沖液洗兩次，白細(xì)胞用細(xì)胞洗滌緩沖液洗兩次，80g離心離心5min。吸出上吸出上清，再把細(xì)胞懸浮在冷的緩沖介質(zhì)中備用。清，再把細(xì)胞懸浮在冷的緩沖介質(zhì)中備用。 （二）梯度（二）梯度-密度離心分離法密度離心分離法 該方法可離出單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）。該方法可離出單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）。 1材料材料 淋巴細(xì)胞分離液；淋巴細(xì)胞分離液；PBS緩沖液。緩沖液。 2方法方法 （1）所用試劑預(yù)熱到）所用試劑預(yù)熱到25以獲得正確的密度。以獲得正確的密度。 （2）取）

14、取5ml外周血用肝素或外周血用肝素或EDTA抗凝，并加等體積抗凝，并加等體積的的PBS稀釋混勻。加稀釋混勻。加2ml淋巴細(xì)胞分離液到圓錐形離心管淋巴細(xì)胞分離液到圓錐形離心管的底部，用吸管取的底部，用吸管取5ml用用PBS稀釋的抗凝血小心地放到淋稀釋的抗凝血小心地放到淋巴細(xì)胞分離液液面上，注意不要使之混合。巴細(xì)胞分離液液面上，注意不要使之混合。 （3）室溫下）室溫下400g離心離心20min，使離心管自行緩慢停使離心管自行緩慢停下，不要用力強(qiáng)迫離心停車。丟棄血漿，用細(xì)尖長吸管吸下，不要用力強(qiáng)迫離心停車。丟棄血漿，用細(xì)尖長吸管吸出含有單個(gè)核細(xì)胞的淡黃色層，置另一個(gè)離心管內(nèi)。出含有單個(gè)核細(xì)胞的淡黃色

15、層，置另一個(gè)離心管內(nèi)。 （4）加）加10ml PBS 600g離心離心10min，洗兩次。把細(xì)洗兩次。把細(xì)胞在懸浮在胞在懸浮在2ml的的PBS中備用。中備用。 四、石蠟標(biāo)本制備單細(xì)胞懸液四、石蠟標(biāo)本制備單細(xì)胞懸液 （1）修塊：切去多余的壞死組織和基質(zhì)組織。切）修塊：切去多余的壞死組織和基質(zhì)組織。切5片片50m厚蠟片標(biāo)本放在一個(gè)厚蠟片標(biāo)本放在一個(gè)10ml的試管里。的試管里。 （2）脫蠟：加入）脫蠟：加入5ml二甲苯，二甲苯，10min3次。次。 （3）水化：）水化：100%乙醇乙醇510min2次；次；95%乙醇乙醇5l0min2次；次；70%乙醇乙醇510min2次；次；50%乙醇乙醇510m

16、in2次；蒸流水洗次；蒸流水洗5min3次，丟棄蒸流水。次，丟棄蒸流水。 （6）消化：加入）消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶消化液（生理鹽胃蛋白酶消化液（生理鹽水配制）水配制）37保溫保溫3050min，每隔每隔10min振蕩一次。用振蕩一次。用鑷子或玻璃棒取出未消化完的組織，并加等量生理鹽水鑷子或玻璃棒取出未消化完的組織，并加等量生理鹽水終止酶的作用。經(jīng)終止酶的作用。經(jīng)50m尼龍網(wǎng)過濾。尼龍網(wǎng)過濾。 五、細(xì)胞固定五、細(xì)胞固定 固定的目的是使細(xì)胞或組織硬化足以承受包固定的目的是使細(xì)胞或組織硬化足以承受包埋和切片的處理。固定也使得細(xì)胞膜變得通透，埋和切片的處理。固定也使得細(xì)胞膜變得通透，使染料

17、能夠進(jìn)入，獲得最佳染色效果、并通過抑使染料能夠進(jìn)入，獲得最佳染色效果、并通過抑制微生物作用和自溶保護(hù)細(xì)胞樣品。作為流式細(xì)制微生物作用和自溶保護(hù)細(xì)胞樣品。作為流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞以懸浮狀態(tài)使用，常用的固定劑有乙胞術(shù)，細(xì)胞以懸浮狀態(tài)使用，常用的固定劑有乙醇、甲醇、甲醛和戊二醛等。醇、甲醇、甲醛和戊二醛等。DNA定量分析細(xì)胞定量分析細(xì)胞多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和多聚甲多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和多聚甲醛等固定以保護(hù)細(xì)胞膜表面的特異標(biāo)志物。醛等固定以保護(hù)細(xì)胞膜表面的特異標(biāo)志物。 1乙醇固定乙醇固定 常用常用75%乙醇。用無鈣鎂的乙醇。用無鈣鎂的PBS配配制，制，4冰箱中保存。將洗過的細(xì)胞

18、用冰箱中保存。將洗過的細(xì)胞用0.5ml PBS懸浮起懸浮起來，用加樣器或吸管把細(xì)胞懸液噴射入來，用加樣器或吸管把細(xì)胞懸液噴射入5ml 75%冷乙醇冷乙醇中。將容器口密封，中。將容器口密封，4冰箱貯存，時(shí)間不少冰箱貯存，時(shí)間不少30min。 2免疫染色后的固定免疫染色后的固定 對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行免疫對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行免疫標(biāo)記染色后，如果不能立即進(jìn)行標(biāo)記染色后，如果不能立即進(jìn)行FCM分析，可用下列方分析，可用下列方法固定保存：法固定保存： （1）在細(xì)胞免疫標(biāo)記染色完成細(xì)胞洗滌后，加入）在細(xì)胞免疫標(biāo)記染色完成細(xì)胞洗滌后，加入3%的甲醛，細(xì)胞搖勻后的甲醛，細(xì)胞搖勻后4冰箱保存。冰箱保存。24h之內(nèi)分析

19、，之內(nèi)分析，其熒光強(qiáng)度不變。其熒光強(qiáng)度不變。 （2）用）用0.5%的多聚甲醛搖勻固定，的多聚甲醛搖勻固定，4冰箱保存，冰箱保存，一周內(nèi)熒光強(qiáng)度基本不變。一周內(nèi)熒光強(qiáng)度基本不變。第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞的熒光標(biāo)記細(xì)胞的熒光標(biāo)記 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的分析一是分析細(xì)胞產(chǎn)生流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的分析一是分析細(xì)胞產(chǎn)生的散射光信號(hào)；二是分析細(xì)胞所產(chǎn)生的熒光信號(hào)。的散射光信號(hào)；二是分析細(xì)胞所產(chǎn)生的熒光信號(hào)。細(xì)胞的熒光是由一些能夠定量的熒光染料與細(xì)胞細(xì)胞的熒光是由一些能夠定量的熒光染料與細(xì)胞內(nèi)的特有成分結(jié)合，或經(jīng)抗原抗體反應(yīng)使熒光染內(nèi)的特有成分結(jié)合，或經(jīng)抗原抗體反應(yīng)使熒光染料與細(xì)胞間接結(jié)合，經(jīng)激光照射產(chǎn)生的。本節(jié)主料與細(xì)

20、胞間接結(jié)合，經(jīng)激光照射產(chǎn)生的。本節(jié)主要介紹熒光染料直接與細(xì)胞內(nèi)部特有成分結(jié)合定要介紹熒光染料直接與細(xì)胞內(nèi)部特有成分結(jié)合定量分析的熒光標(biāo)記方法，如量分析的熒光標(biāo)記方法，如DNA、RNA、蛋白等。蛋白等。 一、常用熒光染料一、常用熒光染料 在流式細(xì)胞術(shù)中使用的熒光染料可分兩大在流式細(xì)胞術(shù)中使用的熒光染料可分兩大類：一類是染料生物大分子基團(tuán)，如免疫球蛋類：一類是染料生物大分子基團(tuán)，如免疫球蛋白，再與細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，使染料分子間接白，再與細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，使染料分子間接地連接到細(xì)胞上（表地連接到細(xì)胞上（表13-1）；另一類是直接與）；另一類是直接與細(xì)胞內(nèi)特異成分相結(jié)合的染料，它們之間有非細(xì)胞內(nèi)特異成分相結(jié)合的染料，它們之間有非常好的線性關(guān)系（表常好的線性關(guān)系（表13-2）。在實(shí)驗(yàn)過程中，）。在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)根據(jù)儀器的實(shí)際情況，例如激發(fā)光源