真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)3

1、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱 真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系 大腸桿菌的表達(dá)載體大腸桿菌的表達(dá)載體 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)真核基因在大腸桿菌中的表達(dá) 影響真核基因表達(dá)效率的因素影響真核基因表達(dá)效率的因素第一節(jié)第一節(jié) 真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系1. 1. 大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌表達(dá)體系n基因工程的重要目標(biāo)基因工程的重要目標(biāo) 制備大量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物制備大量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物 因此，要選擇能高水平表達(dá)異源真核蛋白的因此，要選擇能高水平表達(dá)異源真核蛋白的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)n目前常用的表達(dá)系統(tǒng)目前常用的表達(dá)系統(tǒng)

2、細(xì)菌（大腸桿菌）、酵母、昆蟲細(xì)胞、植細(xì)菌（大腸桿菌）、酵母、昆蟲細(xì)胞、植物和哺乳動物細(xì)胞等物和哺乳動物細(xì)胞等背景清楚，特別是對其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)背景清楚，特別是對其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理研究的比較深入。理研究的比較深入。安全安全(被被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物)，且有多種不同的菌株和質(zhì)粒載體。且有多種不同的菌株和質(zhì)粒載體。已有許多真核基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。已有許多真核基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，因此易于進(jìn)培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，因此易于進(jìn)行批量生產(chǎn)。行批量生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性

3、p真核基因與原核基因的差別：真核基因與原核基因的差別：編碼基因的不連續(xù)編碼基因的不連續(xù)性，含有內(nèi)含子序列，大腸桿菌不具備對性，含有內(nèi)含子序列，大腸桿菌不具備對pre-RNA進(jìn)行加工剪接的能力。進(jìn)行加工剪接的能力。pmRNAmRNA分子結(jié)構(gòu)的差異：分子結(jié)構(gòu)的差異：真核基因真核基因mRNA 5-mRNA 5-端有端有帽子結(jié)構(gòu)，帽子結(jié)構(gòu)，3-3-端有端有poly(A)poly(A)尾巴，影響其穩(wěn)定性及尾巴，影響其穩(wěn)定性及與細(xì)菌核糖體結(jié)合的能力。與細(xì)菌核糖體結(jié)合的能力。大腸桿菌表達(dá)真核基因的劣勢大腸桿菌表達(dá)真核基因的劣勢p轉(zhuǎn)錄信號的不同：轉(zhuǎn)錄信號的不同：真核基因轉(zhuǎn)錄的真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不具不具備結(jié)

4、合細(xì)菌核糖體所必須的備結(jié)合細(xì)菌核糖體所必須的SD序列；細(xì)菌的序列；細(xì)菌的RNA聚合酶不能識別真核啟動子。聚合酶不能識別真核啟動子。大腸桿菌表達(dá)真核基因的劣勢大腸桿菌表達(dá)真核基因的劣勢原 核 生 物 啟 動 子 的 結(jié) 構(gòu)5 N N N N N T T G A C A N N N N N N N N N N N N N N N N N T A T A T T N N N N N N A N N N N 3 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 起起 始始 位位 點(diǎn)點(diǎn)- - 1 1 0 0 區(qū)區(qū)- - 3 3 5 5 區(qū)區(qū)真 核 生 物 啟 動 子 的 結(jié) 構(gòu)5 N N N N N N N N N N N N N N N

5、N N T A T A A A N N N N N N N N N N N N N N N N A N N N N 3 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 起起 始始 位位 點(diǎn)點(diǎn)- - 2 2 5 5 區(qū)區(qū)T A T A T Ap蛋白質(zhì)產(chǎn)物的后修飾：蛋白質(zhì)產(chǎn)物的后修飾：許多真核基因的蛋白質(zhì)許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物存在翻譯后的修飾過程，如磷酸化、糖基產(chǎn)物存在翻譯后的修飾過程，如磷酸化、糖基化等。大腸桿菌中無此過程，因此，表達(dá)的蛋化等。大腸桿菌中無此過程，因此，表達(dá)的蛋白無法正確折疊，由此產(chǎn)生的三級結(jié)構(gòu)通常是白無法正確折疊，由此產(chǎn)生的三級結(jié)構(gòu)通常是不可溶的，常形成包涵體，無活性。不可溶的，常形成包涵體，無活性。p蛋白酶的

6、降解：蛋白酶的降解：表達(dá)的真核蛋白質(zhì)被細(xì)菌的蛋表達(dá)的真核蛋白質(zhì)被細(xì)菌的蛋白酶識別并降解。白酶識別并降解。大腸桿菌表達(dá)真核基因的劣勢大腸桿菌表達(dá)真核基因的劣勢解決方案解決方案從真核細(xì)胞中分離完整加工的從真核細(xì)胞中分離完整加工的mRNA，采用反轉(zhuǎn)，采用反轉(zhuǎn)錄合成錄合成cDNA，并連接到載體上，以克服內(nèi)含子問，并連接到載體上，以克服內(nèi)含子問題。題。如果知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列，且分子量不太大，如果知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化學(xué)方法合成不含內(nèi)含子序列的寡聚核苷可以用化學(xué)方法合成不含內(nèi)含子序列的寡聚核苷酸片斷。酸片斷。將克隆的真核基因插入到原核啟動子的下游。將克隆的真核基因插入到原核啟

7、動子的下游。對于細(xì)菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通過對于細(xì)菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通過突變的方法消除。突變的方法消除。2. 2. 克隆基因正確表達(dá)的基本條件克隆基因正確表達(dá)的基本條件n最基本條件：能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯最基本條件：能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯 轉(zhuǎn)錄：真核基因置于原核啟動子的下游轉(zhuǎn)錄：真核基因置于原核啟動子的下游 3-末端具有轉(zhuǎn)錄終止子末端具有轉(zhuǎn)錄終止子 翻譯：翻譯： mRNA分子具有分子具有RBS（ribosome binding site） 包括包括AUG或或GUG和與和與16S rRNA 3-末端末端互補(bǔ)的互補(bǔ)的SD（Shine-Dalgarno）序列。）序列。n另

8、一個(gè)重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能另一個(gè)重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性維持正常的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白被大腸桿菌蛋白酶降解。表達(dá)蛋白被大腸桿菌蛋白酶降解。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)形成的速率與其穩(wěn)定性有關(guān)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)形成的速率與其穩(wěn)定性有關(guān)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的正確形成需要分子伴侶的參與。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的正確形成需要分子伴侶的參與。大腸桿菌不可能對所有外源蛋白都存在正確的分大腸桿菌不可能對所有外源蛋白都存在正確的分子伴侶。子伴侶。第二節(jié)第二節(jié) 大腸桿菌的表達(dá)載體大腸桿菌的表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)特征大腸桿菌表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)特征核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動子啟動子轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子

9、復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)1. 1. 表達(dá)載體的基本成分表達(dá)載體的基本成分u啟動子（啟動子（P P）：影響外源基因的表達(dá)水平）：影響外源基因的表達(dá)水平 使外源基因高水平表達(dá)必須具備的條件：使外源基因高水平表達(dá)必須具備的條件：強(qiáng)啟動子強(qiáng)啟動子啟動子呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平：表達(dá)的外啟動子呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平：表達(dá)的外源蛋白可能對寄主細(xì)胞不利。源蛋白可能對寄主細(xì)胞不利。誘導(dǎo)型啟動子：能通過簡單的方式使用廉價(jià)的誘誘導(dǎo)型啟動子：能通過簡單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物使外源基因獲得表達(dá)，如導(dǎo)物使外源基因獲得表達(dá)，如IPTG、溫度等。、溫度等。u轉(zhuǎn)錄終止子（轉(zhuǎn)錄終止子（TTTT）上游啟動子會抑制下游啟動子上游啟動

10、子會抑制下游啟動子的轉(zhuǎn)錄功能的轉(zhuǎn)錄功能(啟動子封堵作用啟動子封堵作用)，因此需要在克隆基因編碼區(qū)的因此需要在克隆基因編碼區(qū)的3-末端接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終末端接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子。止子。轉(zhuǎn)錄終止子能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子能增強(qiáng)mRNA分子分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。物的水平。u翻譯起始序列翻譯起始序列：決定：決定mRNA翻譯起始效率。翻譯起始效率。 未鑒定出其保守結(jié)構(gòu)，只能采取一些方法降未鑒定出其保守結(jié)構(gòu)，只能采取一些方法降低低mRNA 5-末端二級結(jié)構(gòu)的形成，增加末端二級結(jié)構(gòu)的形成，增加RBS中中A、T含量，堿基定點(diǎn)突變等含量，堿基定點(diǎn)突變等。u增強(qiáng)子增強(qiáng)子：

11、特殊的序列元件，能顯著增強(qiáng)外：特殊的序列元件，能顯著增強(qiáng)外源基因的表達(dá)效率。源基因的表達(dá)效率。u翻譯終止子翻譯終止子：必須存在終止密碼子。：必須存在終止密碼子。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)通常裝上全部的三個(gè)終止密碼子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)通常裝上全部的三個(gè)終止密碼子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖體的跳躍現(xiàn)象。，以阻止核糖體的跳躍現(xiàn)象。大腸桿菌最偏愛的密碼子：大腸桿菌最偏愛的密碼子：UAA當(dāng)為四聯(lián)核苷酸當(dāng)為四聯(lián)核苷酸UAAU時(shí)，終止效率進(jìn)一步增強(qiáng)。時(shí)，終止效率進(jìn)一步增強(qiáng)。2. 2. 常用的大腸桿菌表達(dá)載體常用的大腸桿菌表達(dá)載體LacLac啟動子的表達(dá)載體啟動子的表達(dá)載體T7T7啟動子的表達(dá)載體啟動子的表達(dá)載

12、體 Lac Lac啟動子的表達(dá)載體啟動子的表達(dá)載體乳糖操縱子結(jié)構(gòu)模型乳糖操縱子結(jié)構(gòu)模型nlac操縱子受操縱子受lac阻遏物的負(fù)調(diào)節(jié)。阻遏物的負(fù)調(diào)節(jié)。n培養(yǎng)基中缺乏乳糖或其它誘導(dǎo)物時(shí)，培養(yǎng)基中缺乏乳糖或其它誘導(dǎo)物時(shí)， lac阻遏物同阻遏物同操縱單元結(jié)合，關(guān)閉乳糖操縱子的活動。操縱單元結(jié)合，關(guān)閉乳糖操縱子的活動。n培養(yǎng)基中加入乳糖或其它誘導(dǎo)物培養(yǎng)基中加入乳糖或其它誘導(dǎo)物(IPTG)時(shí)，同阻時(shí)，同阻遏物結(jié)合，使乳糖操縱子去阻遏。遏物結(jié)合，使乳糖操縱子去阻遏。 因此，我們可以通過加入因此，我們可以通過加入IPTG誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)外源基誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。因的表達(dá)。nLac操縱子的控制區(qū)，包括操縱子的控

13、制區(qū)，包括核糖體核糖體結(jié)合區(qū)、結(jié)合區(qū)、RNA聚合酶聚合酶結(jié)合區(qū)及阻遏物結(jié)合區(qū)都位于長結(jié)合區(qū)及阻遏物結(jié)合區(qū)都位于長203 bp的的HaeIII片斷上。片斷上。n203 bp的的HaeIII片斷含有片斷含有Lac啟動子、操縱單元及啟動子、操縱單元及-半乳半乳糖苷酶的前糖苷酶的前8個(gè)密碼子。個(gè)密碼子。n將該片斷插入到質(zhì)粒中，構(gòu)建含有將該片斷插入到質(zhì)粒中，構(gòu)建含有l(wèi)ac啟動子的質(zhì)粒表達(dá)啟動子的質(zhì)粒表達(dá)載體。載體。n這種多拷貝質(zhì)粒中的操縱單元可以把大腸桿菌中所這種多拷貝質(zhì)粒中的操縱單元可以把大腸桿菌中所有的有的Lac阻遏物都結(jié)合掉，使細(xì)菌染色體的阻遏物都結(jié)合掉，使細(xì)菌染色體的-半乳半乳糖苷酶基因解抑制。

14、糖苷酶基因解抑制。n含有質(zhì)粒載體（含有質(zhì)粒載體（Lac啟動子、操縱單元）的大腸桿啟動子、操縱單元）的大腸桿菌能夠合成菌能夠合成-半乳糖苷酶，因此菌落在加有半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物底物)的瓊脂平板上呈藍(lán)色。的瓊脂平板上呈藍(lán)色。n這種顯色反應(yīng)可用來快速鑒定陽性克隆。這種顯色反應(yīng)可用來快速鑒定陽性克隆。T7 噬菌體啟動子噬菌體啟動子：它是來自：它是來自T7噬菌體的啟動噬菌體的啟動子，具有高度的特異性。子，具有高度的特異性。只有只有T7 RNA聚合酶才能使其啟動，故可以使克聚合酶才能使其啟動，故可以使克隆化基因獨(dú)自得到表達(dá)。隆化基因獨(dú)自得到表達(dá)。T7 RNA聚合酶的效率聚合酶的效率比

15、大腸桿菌比大腸桿菌 RNA聚合酶高聚合酶高5倍左右倍左右 第三節(jié)第三節(jié) 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)1. 1. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位n細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)：易形成包涵體：易形成包涵體包涵體：由不可溶性蛋白聚集折疊形成，是外源基因高包涵體：由不可溶性蛋白聚集折疊形成，是外源基因高效表達(dá)時(shí)常發(fā)生的一種特殊生理現(xiàn)象。效表達(dá)時(shí)常發(fā)生的一種特殊生理現(xiàn)象。包涵體形成的理化參數(shù)：包涵體形成的理化參數(shù)： 電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基的組分、半胱氨電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基的組分、半胱氨酸的組分、脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的

16、總數(shù)。酸的組分、脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的總數(shù)。表達(dá)蛋白形成包涵體的優(yōu)缺點(diǎn)：表達(dá)蛋白形成包涵體的優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：易于分離優(yōu)點(diǎn)：易于分離 蛋白被保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解蛋白被保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解 蛋白質(zhì)沒有活性，不會對寄主細(xì)胞造成傷害蛋白質(zhì)沒有活性，不會對寄主細(xì)胞造成傷害 缺點(diǎn)：很難恢復(fù)生物學(xué)活性缺點(diǎn)：很難恢復(fù)生物學(xué)活性 蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量低蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量低解決方案：限制包涵體的形成解決方案：限制包涵體的形成 外源基因外源基因與分子伴侶共表達(dá)與分子伴侶共表達(dá)分子伴侶：能夠阻止聚合作用而使蛋白質(zhì)正確折疊。分子伴侶：能夠阻止聚合作用而使蛋白質(zhì)正確折疊。 使用硫氧還蛋白缺陷的寄主菌株使用硫氧還蛋白

17、缺陷的寄主菌株 目的：維持有利的氧化還原電位目的：維持有利的氧化還原電位 低溫誘導(dǎo)，降低蛋白質(zhì)的合成速率低溫誘導(dǎo)，降低蛋白質(zhì)的合成速率 與高可溶性的多肽融合表達(dá)與高可溶性的多肽融合表達(dá)1. 稀釋復(fù)性：稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。稀釋法主要有一次加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。2. 透析復(fù)性透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，

18、但可能形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適控制變性劑去除速度，但可能形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。3. 超濾復(fù)性超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。能在超濾過程中不可逆的變性。包涵體蛋白復(fù)性方法包涵體蛋白復(fù)性方法4. 柱上復(fù)性柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，

19、在色譜柱上復(fù)性，大致可分復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復(fù)性，大致可分成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)性均是用成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)性均是用Sephacry1S-100或或Superdex75 等分子篩填料，柱較長等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復(fù)性回收率高（高達(dá)復(fù)性回收率高（高達(dá)90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)?。ㄒ话阄灞蹲笥遥┍稊?shù)?。ㄒ话阄灞蹲笥遥?. 高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)：通

20、常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性；二是采入過程中或加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性；二是采用溫度跳躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋用溫度跳躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速提白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速提高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。6. 添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法：包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用

21、可以分為：穩(wěn)定包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。溶解性。 a、共溶劑：如、共溶劑：如PEG600020000、甘油等、甘油等b、去污劑及表面活性劑：如、去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs 等等C、氧化、氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加 入氧化還原體系，如入氧化還原體系，如GSH/GSSG

22、 等等d、0.40.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率 e、分子伴侶和折疊酶、分子伴侶和折疊酶 n周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)中表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：周質(zhì)中細(xì)胞蛋白少，有利于外源蛋白的純化。優(yōu)點(diǎn)：周質(zhì)中細(xì)胞蛋白少，有利于外源蛋白的純化。 周質(zhì)中的氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。周質(zhì)中的氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。 周質(zhì)中蛋白質(zhì)的降解作用小。周質(zhì)中蛋白質(zhì)的降解作用小。條件：需要信號肽的引

23、導(dǎo)，使表達(dá)蛋白由細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)條件：需要信號肽的引導(dǎo)，使表達(dá)蛋白由細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn) 運(yùn)到周質(zhì)。運(yùn)到周質(zhì)。 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程相當(dāng)復(fù)雜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程相當(dāng)復(fù)雜 蛋白質(zhì)跨膜過程還與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。蛋白質(zhì)跨膜過程還與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。 即使存在信號肽，也不能保證蛋白正確轉(zhuǎn)運(yùn)到周即使存在信號肽，也不能保證蛋白正確轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中。質(zhì)中。如：免疫球蛋白與如：免疫球蛋白與T-細(xì)胞受體分子結(jié)構(gòu)相似。細(xì)胞受體分子結(jié)構(gòu)相似。 免疫球蛋白可以在周質(zhì)中表達(dá)。免疫球蛋白可以在周質(zhì)中表達(dá)。 T-細(xì)胞受體不能在周質(zhì)中表達(dá)。細(xì)胞受體不能在周質(zhì)中表達(dá)。n細(xì)胞外表達(dá)細(xì)胞外表達(dá)：易于分離純化，但相當(dāng)困難。：易于分離純化，但相當(dāng)困難。n原因：細(xì)菌細(xì)

24、胞有兩層膜，即內(nèi)膜和外膜，表達(dá)蛋白原因：細(xì)菌細(xì)胞有兩層膜，即內(nèi)膜和外膜，表達(dá)蛋白 需跨越兩層膜屏障。需跨越兩層膜屏障。n解決方案：解決方案： 利用大腸桿菌固有的途徑：將外源蛋白與利用大腸桿菌固有的途徑：將外源蛋白與 E. coli分泌型蛋白融合表達(dá)。分泌型蛋白融合表達(dá)。 增加增加E. coli細(xì)胞外膜的滲漏性：信號肽序列、細(xì)胞外膜的滲漏性：信號肽序列、透化劑、與細(xì)菌素釋放蛋白或具透化作用的基因共表達(dá)。透化劑、與細(xì)菌素釋放蛋白或具透化作用的基因共表達(dá)。2. 2. 融合蛋白的表達(dá)融合蛋白的表達(dá)融合基因的概念：具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以融合基因的概念：具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。

25、上不同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA體外重組構(gòu)建的融合基因：體外重組構(gòu)建的融合基因：兩個(gè)或以上不同基因的編碼序列組成的融合基因：兩個(gè)或以上不同基因的編碼序列組成的融合基因：編碼產(chǎn)物為單一的多肽序列，稱為融合蛋白、雜編碼產(chǎn)物為單一的多肽序列，稱為融合蛋白、雜種蛋白、嵌合蛋白。種蛋白、嵌合蛋白。表達(dá)融合蛋白的策略表達(dá)融合蛋白的策略F用融合載體表達(dá)融合蛋白質(zhì)：在設(shè)計(jì)時(shí)注意外源基因與用融合載體表達(dá)融合蛋白質(zhì)：在設(shè)計(jì)時(shí)注意外源基因與靶基因連接后仍保持正確的讀碼框。靶基因連接后仍保持正確的讀碼框。BamHI, SmaI, EcoRI, XbaI, NcoI, SalI XhoI, SacI, Hind

26、IIIpGEX-KG5.0 kbPtacBspMIBalIPstIAlwN IpBR2332 oriMlu IBstE IINar IEcoR VBssH IIStop CodonsIGSTAmpLac IGA ATT CTA GAEco RIXba I融合蛋白的純化：融合蛋白的純化：利用與融合蛋白中的配偶體相對應(yīng)的配體作為吸附劑，利用與融合蛋白中的配偶體相對應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱。制備親和層析柱。通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白被滯留下來，其它蛋白則流出柱外。被滯留下來，其它蛋白則流出柱外。通過洗脫處理，可回收到純化的融

27、合蛋白。通過洗脫處理，可回收到純化的融合蛋白。融合蛋白的切割：配偶體的存在可能影響融合蛋融合蛋白的切割：配偶體的存在可能影響融合蛋白的功能。白的功能。方法：方法：化學(xué)切割：化學(xué)切割：如溴化氰特異切割甲硫氨酸殘基，如溴化氰特異切割甲硫氨酸殘基，AUG不是不是起始密碼子時(shí)編碼，適合鏈內(nèi)不含起始密碼子時(shí)編碼，適合鏈內(nèi)不含甲硫氨酸殘基的多肽甲硫氨酸殘基的多肽的切割。的切割。MetGST外源蛋白 酶切割：酶切割：如凝血因子如凝血因子Xa，在融合基因之間插入編碼，在融合基因之間插入編碼Xa的識別序列，融合蛋白純化后可用的識別序列，融合蛋白純化后可用Xa切除大腸桿菌的多切除大腸桿菌的多肽，得到天然的目標(biāo)蛋白

28、。肽，得到天然的目標(biāo)蛋白。Ile-Glu-Gly-ArgGST外源蛋白3. 3. 外源蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定性外源蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定性 影響因素：影響因素：n蛋白的酶解作用：細(xì)菌細(xì)胞的蛋白酶能選擇性地酶蛋白的酶解作用：細(xì)菌細(xì)胞的蛋白酶能選擇性地酶解異常蛋白質(zhì)，包括外源蛋白。解異常蛋白質(zhì)，包括外源蛋白。 解決方案：解決方案：外源蛋白在周質(zhì)或胞外表達(dá)外源蛋白在周質(zhì)或胞外表達(dá) 使用蛋白酶缺陷的菌株使用蛋白酶缺陷的菌株 低溫培養(yǎng)、與分子伴侶共表達(dá)低溫培養(yǎng)、與分子伴侶共表達(dá) 消除蛋白酶切割位點(diǎn)、目標(biāo)蛋白的疏水性修飾消除蛋白酶切割位點(diǎn)、目標(biāo)蛋白的疏水性修飾n結(jié)構(gòu)決定因子：結(jié)構(gòu)決定因子：N-氨基酸性質(zhì)及

29、內(nèi)部的氨基酸性質(zhì)及內(nèi)部的PEST序列序列nN-端法則：端法則：N-端為精端為精aa、賴、賴aa、亮、亮aa、苯丙、苯丙aa、酪、酪aa、色、色aa時(shí)，蛋時(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差。白質(zhì)的穩(wěn)定性差。nN-端附近的內(nèi)部賴端附近的內(nèi)部賴aa是遍在蛋白質(zhì)的受體，易受依賴于遍在蛋白質(zhì)是遍在蛋白質(zhì)的受體，易受依賴于遍在蛋白質(zhì)的蛋白酶降解。的蛋白酶降解。nPEST序列：指真核蛋白中富含脯序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷、谷aa、絲、絲aa、蘇、蘇aa的區(qū)段，的區(qū)段，易發(fā)生胞內(nèi)降解，該序列的磷酸化作用增加了與鈣離子結(jié)合，從而易發(fā)生胞內(nèi)降解，該序列的磷酸化作用增加了與鈣離子結(jié)合，從而促進(jìn)依賴于鈣離子的蛋白酶的降解。促

30、進(jìn)依賴于鈣離子的蛋白酶的降解。n表達(dá)部位：周質(zhì)與胞外所含蛋白酶較少，在這些部位表達(dá)部位：周質(zhì)與胞外所含蛋白酶較少，在這些部位表達(dá)的蛋白不易被降解。表達(dá)的蛋白不易被降解。n分子伴侶的穩(wěn)定作用：阻止聚合作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)的分子伴侶的穩(wěn)定作用：阻止聚合作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。正確折疊。 一種分子伴侶的超量表達(dá)無法使蛋白正確折疊，不同一種分子伴侶的超量表達(dá)無法使蛋白正確折疊，不同類型分子伴侶彼此協(xié)調(diào)參與蛋白質(zhì)的折疊。類型分子伴侶彼此協(xié)調(diào)參與蛋白質(zhì)的折疊。如何提高目的蛋白的可溶性表達(dá)如何提高目的蛋白的可溶性表達(dá)1.降低蛋白合成的速度?？梢酝ㄟ^以下降低蛋白合成的速度?？梢酝ㄟ^以下方法實(shí)現(xiàn)：方法實(shí)現(xiàn)： a

31、.降低培養(yǎng)溫度降低培養(yǎng)溫度 b.使用弱啟動子使用弱啟動子 c.使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)載體使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)載體 d.降低誘導(dǎo)物的濃度降低誘導(dǎo)物的濃度2. 改變培養(yǎng)基。改變培養(yǎng)基。 a.培養(yǎng)基中加入可以幫助蛋白折疊的因子培養(yǎng)基中加入可以幫助蛋白折疊的因子 b.加入緩沖液保持加入緩沖液保持pH穩(wěn)定穩(wěn)定 c.加入加入1%的葡萄糖，抑制的葡萄糖，抑制lac啟動子啟動子 d.加入山梨糖醇等可以穩(wěn)定蛋白天然結(jié)構(gòu)加入山梨糖醇等可以穩(wěn)定蛋白天然結(jié)構(gòu)的因子的因子 e.加入乙醇、硫醇等加入乙醇、硫醇等3.與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)。與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)。 常用的分子伴侶有：常用的分子伴侶有： GroES-G

32、roEL DnaK-DnaJ-GrpE ClpB 常用的折疊酶有：常用的折疊酶有： peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIs) disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC) protein disulfide isomerase (PDI) 4.分泌表達(dá)：使目的蛋白分泌到周質(zhì)空間。分泌表達(dá)：使目的蛋白分泌到周質(zhì)空間。n周質(zhì)空間的氧化性的環(huán)境有利于二硫鍵的周質(zhì)空間的氧化性的環(huán)境有利于二硫鍵的形成，而胞內(nèi)則是還原性的。形成，而胞內(nèi)則是還原性的。n周質(zhì)空間有折疊酶周質(zhì)空間有折疊

33、酶DsbA和和DsbC的存在，的存在，幫助蛋白正確折疊。幫助蛋白正確折疊。n周質(zhì)空間很少有蛋白酶存在，不會被水解。周質(zhì)空間很少有蛋白酶存在，不會被水解。n可以使對細(xì)胞有毒性的蛋白大量存在?？梢允箤?xì)胞有毒性的蛋白大量存在。5.使用特定的菌株。使用特定的菌株。nAD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB). nOrigami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor). 6.與可溶性多肽融合表達(dá)。與可溶性多肽

34、融合表達(dá)。7.表達(dá)目的蛋白的一個(gè)片段。大于表達(dá)目的蛋白的一個(gè)片段。大于 70 kDa的的蛋白在大腸桿菌中是很難表達(dá)的。蛋白在大腸桿菌中是很難表達(dá)的。 8.體外去折疊，重新折疊。體外去折疊，重新折疊。 第四節(jié)第四節(jié) 影響真核基因表達(dá)效率的因素影響真核基因表達(dá)效率的因素n影響因素影響因素： 啟動子的強(qiáng)度、啟動子的強(qiáng)度、DNA轉(zhuǎn)錄起始序列轉(zhuǎn)錄起始序列 密碼子的選擇、密碼子的選擇、 mRNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性 寄主細(xì)胞的生理特征等寄主細(xì)胞的生理特征等1. 5-UTR1. 5-UTR對克隆基因表達(dá)效率的影響對克隆基因表達(dá)效率的影響v啟動

35、子結(jié)構(gòu)的影響：啟動子結(jié)構(gòu)的影響：啟動子序列具有啟動子序列具有2種保守序列，即種保守序列，即-35區(qū)區(qū)(5-TTGACA)和和-10區(qū)區(qū)(5-TATAAT)。啟動子序列與此越相似，其表達(dá)能。啟動子序列與此越相似，其表達(dá)能力越強(qiáng)。力越強(qiáng)。-35區(qū)和區(qū)和-10區(qū)之間的距離：也是影響克隆基因表達(dá)效率的區(qū)之間的距離：也是影響克隆基因表達(dá)效率的重要因素。距離越接近重要因素。距離越接近17bp，啟動子的活性越強(qiáng)，啟動子的活性越強(qiáng)。對于某些啟動子，對于某些啟動子，-35區(qū)上游的區(qū)上游的10-100bp序列：起上游激序列：起上游激活物的作用?；钗锏淖饔?。v啟動子與克隆基因之間距離的影響：啟動子與克隆基因之間距離

36、的影響：發(fā)生發(fā)生2-3nt長度的變化，就能顯著影響翻譯的效率。長度的變化，就能顯著影響翻譯的效率。與質(zhì)粒與質(zhì)粒mRNA 5-端的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)：端的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)：SD序列或序列或AUG密碼子參與密碼子參與mRNA分子的堿基配對會明顯降低分子的堿基配對會明顯降低mRNA的翻譯效率。的翻譯效率。要獲得良好表達(dá)，要獲得良好表達(dá)， AUG密碼子或密碼子或SD序列必須處于易接觸的部位，以序列必須處于易接觸的部位，以利于與核糖體結(jié)合起始翻譯過程。利于與核糖體結(jié)合起始翻譯過程。mRNA 5-末端與末端與SD序列的距離也是影響翻譯效率的重要因素，距離序列的距離也是影響翻譯效率的重要因素，距離小于小于15nt時(shí)，

37、翻譯效率會顯著下降。時(shí)，翻譯效率會顯著下降。v提高克隆基因表達(dá)效率的方案：提高克隆基因表達(dá)效率的方案：建立克隆庫：使目的基因放置在與啟動子不同距離的位建立克隆庫：使目的基因放置在與啟動子不同距離的位置上，從重組體中篩選產(chǎn)量最高的克隆。置上，從重組體中篩選產(chǎn)量最高的克隆。對于表達(dá)產(chǎn)物難以測定的基因，可先將其對于表達(dá)產(chǎn)物難以測定的基因，可先將其N-端片斷與報(bào)端片斷與報(bào)告基因融合，再建立克隆庫，通過報(bào)告基因產(chǎn)物的活性告基因融合，再建立克隆庫，通過報(bào)告基因產(chǎn)物的活性來篩選克隆基因有效表達(dá)的重組菌落。最后將該質(zhì)粒中來篩選克隆基因有效表達(dá)的重組菌落。最后將該質(zhì)粒中的報(bào)告基因用克隆基因的的報(bào)告基因用克隆基因

38、的C-端片斷替換端片斷替換，即得到高效表，即得到高效表達(dá)克隆基因的重組質(zhì)粒。達(dá)克隆基因的重組質(zhì)粒。n質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響：質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響：提高表達(dá)效率的途徑：增加提高表達(dá)效率的途徑：增加mRNA的數(shù)量。影響的數(shù)量。影響mRNA合合成速率的因素有兩種，即啟動子的強(qiáng)度和基因的拷貝數(shù)。成速率的因素有兩種，即啟動子的強(qiáng)度和基因的拷貝數(shù)。提高基因的拷貝數(shù)：將其克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。提高基因的拷貝數(shù)：將其克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。n質(zhì)粒的不穩(wěn)定性的影響：發(fā)生質(zhì)粒丟失質(zhì)粒的不穩(wěn)定性的影響：發(fā)生質(zhì)粒丟失保持抗生素的選擇壓力保持抗生素的選擇壓力將質(zhì)粒分配功能區(qū)將質(zhì)粒分配功能區(qū)par克隆到質(zhì)粒載體上克隆到質(zhì)粒載體上2. 2. 質(zhì)粒的生物學(xué)特性對表達(dá)效率