HPLC-MS法測(cè)定人血漿中氯雷他定的濃度及人體生物等效性

1、第23卷第7期2006年7月沈 陽 藥 科 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)Journal of Shenyang Phar maceutical U niv ersityV ol 23 No 7Jul. 2006p 443文章編號(hào):10062006 07044305HPLC/MS 法測(cè)定人血漿中氯雷他定的濃度及人體生物等效性李丹毅, 陳曉輝, 畢開順(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧沈陽110016摘要:目的建立測(cè)定人血漿中氯雷他定的LC/MS 方法, 并應(yīng)用于藥物制劑生物等效性研究。方法18名健康受試者單劑量口服氯雷他定20mg 后, 血漿樣品經(jīng)液液萃取, 通過液相色譜譜聯(lián)用法測(cè)定其質(zhì)量濃度, 并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2、結(jié)果氯雷他定測(cè)定方法的線性為0 520 0 g L -1, 定量下限為0 5 g L -1; 參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t max 為(0 94 0 21 h, 41 2 83 g L -1, max 為(16t 1/2為(9 56 4 21 h, 用梯形法計(jì)算, A UC 0t 為(38 70 6 93 g h L -1; 受試制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t max 為(0 94 0 21 h, max 為(16 45 2 42 g L -1, t 1/2為(8 89 4 06 h, 用梯形法計(jì)算,A UC 0t 為(43 67 9 55 g h L -1, 以AU C 0-t 計(jì)算, 受試制劑相對(duì)生

3、物利用度為(113 4 19 0 %。結(jié)論該法適用于氯雷他定制劑的生物等效性評(píng)價(jià)。關(guān)鍵詞:氯雷他定; 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法; 血漿藥物質(zhì)量濃度; 生物等效性中圖分類號(hào):R 94 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A氯雷他定屬第二代組胺H 1受體拮抗劑類抗過敏藥, 對(duì)外周組胺H 1受體具有高度選擇性親和力, 主要用于治療季節(jié)性、常年性過敏性鼻炎, 急、慢性蕁麻疹等過敏性皮膚病。因其不易透過血腦屏障且與中樞組胺H 1受體親和力極低, 故無中樞抑制、抗膽堿能作用及心血管毒性等不良反應(yīng)。其特點(diǎn)是起效快、作用強(qiáng)、維持時(shí)間長、不良反應(yīng)少而輕微。作者采用高效液相色譜質(zhì)譜(LC M S 法, 測(cè)定人血漿中氯雷他定的濃度, 并對(duì)2

4、種氯雷他定膠囊的生物等效性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。業(yè)有限公司, 批號(hào):20040601, 10mg /粒, 參比制劑 , 乙腈(色譜純, 美國天地公司 , 空白人血漿由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院提供。2 方法2 1 色譜條件Kromasil C 8色譜柱(150mm ! 4 6mm, 5 m, 大連中匯達(dá)公司 , C 18保護(hù)柱(10mm ! 4 6mm, 大連中匯達(dá)公司 , 流動(dòng)相為乙腈水甲酸(體積比為75 025 01 5 , 流速為0 8mL min -1, 柱溫為室溫。2 2 質(zhì)譜條件離子源為大氣壓化學(xué)電離源(APCI , 接口溫度為400#, CDL 溫度250#, 加熱塊溫度200#, 霧化氣(N 2 流

5、量2 5L min -1, 干燥氣(N2 流量2 0L min -1, 檢測(cè)電壓1 4kV, 正離子方式檢測(cè), 掃描方式為選擇離子檢測(cè)(SIM , 用于定量分析的離子分別為m /z 383 0(氯雷他定 和m /z 284 7(地西泮 。2 3 血漿樣品處理取血漿樣品500 L 置10mL 具塞離心管中, 依次加入甲醇50 L, 內(nèi)標(biāo)溶液(400 g L -11 儀器與試藥2010A 型單重四極桿質(zhì)譜儀(APCI 源, 日本島津公司 , LC 10ATvp 液相色譜輸液泵(日本島津公司 , LC M S Solution 3 0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本島津公司 。氯雷他定對(duì)照品(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)99 6

6、%, 批號(hào):040103, 北京深文科技開發(fā)有限責(zé)任公司 , 地西泮(內(nèi)標(biāo), 含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)99 5%, 批號(hào):040520, 北京深文科技開發(fā)有限責(zé)任公司 , 氯雷他定膠囊(沈陽藥科大學(xué)研制, 批號(hào):20040801, 10mg /粒, 受試制劑 , 海王抒瑞(氯雷他定膠囊, 深圳海王藥地西泮甲醇溶液 25 L, 堿化試劑(2mol L -1氫收稿日期:200602作者簡介:李丹毅(1979, 女(漢族 , 山東濰坊人, 碩士研究生; 畢開順(1956 , 男(漢族 , 河北唐山人, 教授, 主要從事藥物分析及中藥現(xiàn)代化研究, Tel . 02423986296, E bikaishunyah

7、oo com 。氧化鈉水溶液 50 L, 混勻, 加提取溶劑乙醚己烷(體積比為1 51 0 3 0mL, 渦旋3min, 離心(4000r min 5min, 分取上清液置另一試管中, 于40#空氣流下吹干, 殘留物加流動(dòng)相200 L, 超聲1min, 渦旋1min, 離心(12000r min -1 3min, 取上清液20 L 進(jìn)樣分析。2 4 生物等效性及藥物動(dòng)力學(xué)采用開放、隨機(jī)、交叉、單劑量給藥方式, 18名健康受試者均為男性, 年齡為2025歲, 身高為165180cm, 體質(zhì)量在標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的 10%之內(nèi), 隨機(jī)分為甲、乙2組, 每組9人。受試者試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物, 試驗(yàn)前在

8、遼寧省人民醫(yī)院接受全面體檢(包括血常規(guī)、肝、腎功能及心電圖檢查等 , 結(jié)果均屬正常。試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試驗(yàn)前18人均簽署知情同意書。受試者于試驗(yàn)前一天晚900開始禁食, 試驗(yàn)日清晨空腹給藥, 第1周期甲組口服參比制劑2粒(相當(dāng)于氯雷他定20mg , 乙組口服受試制劑2粒(相當(dāng)于氯雷他定20mg ; 第2周期甲組口服受試制劑2粒, 乙組口服參比制劑2粒。每次試驗(yàn)間隔為一星期。服藥后2h 后自由飲水, 4h 和9h 后進(jìn)食統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)餐, 醫(yī)院醫(yī)生同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格的臨床監(jiān)護(hù), 以保證受試者的安全。自服藥前(0h 和服藥后0 33、0 66、1 00、1 50、2 00、3 00、4 00、6

9、 00、8 00、12 00和24 00h 由肘正中靜脈取血5mL, 分離血漿, -20#保存待測(cè)。測(cè)定血漿樣品時(shí), 每天建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并隨行測(cè)定低、中、高3種質(zhì)量濃度(雙樣本 的QC 樣品。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求算QC 樣品和未知樣品的濃度。當(dāng)QC 樣品高質(zhì)量濃度點(diǎn)偏差RE 15%, 低質(zhì)量濃度點(diǎn)偏差RE 20%時(shí), 當(dāng)日數(shù)據(jù)方可接受。-1譜圖1A; 將一定濃度的氯雷他定對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中, 依同法操作, 得色譜圖1C, 氯雷他定和地西泮(內(nèi)標(biāo)物 的保留時(shí)間分別為2 11min 和3 24m in 。取受試者口服給藥后的血漿樣品, 同法操作, 得色譜圖1D 。結(jié)果表明,

10、 空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾血漿中氯雷他定和地西泮的測(cè)定。3 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限取空白血漿500 L, 加氯雷他定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 L, 配制成相當(dāng)于氯雷他定血漿質(zhì)量濃度為0 5、1 0、2 0、5 0、10 0、20 0 g L -1的模擬血漿樣品, 按%2 3&條方法操作, 每一質(zhì)量濃度進(jìn)行雙樣本分析, 進(jìn)樣20 L, 記錄色譜圖, 以氯雷他定質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo), 氯雷他定與地西泮(內(nèi)標(biāo)2物 的峰面積比值為縱坐標(biāo), 用加權(quán)(w =1/ 最小二乘法1進(jìn)行回歸運(yùn)算, 求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。氯雷他定的典型回歸方程為:Y =8 7! 10 +0 172, r =0 9

11、942。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 氯雷他定的線性為0 520 0 g L -1, 定量下限為0 5 g L -1, 見色譜圖1B 。3 3 精密度與準(zhǔn)確度取空白血漿500 L, 按%3 2&條方法制成氯雷他定低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(氯雷他定質(zhì)量濃度分別為1 0、5 0、16 0 g L -1 的質(zhì)量控制(QC 樣品, 每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析, 連續(xù)測(cè)定3天, 根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算QC 樣品的質(zhì)量濃度, 將QC 樣品的結(jié)果進(jìn)行方差分析, 求算本法的準(zhǔn)確度與精密度, 結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明, 日內(nèi)、日間精密度(RSD 均小于15 0%, 準(zhǔn)確度(RE 在 5 0%以內(nèi)。3 4 提取回收率

12、和穩(wěn)定性考察取空白血漿500 L, 按%3 2&條方法制備氯雷他定低、中、高3個(gè)濃度(氯雷他定分別為1 0、5 0、16 0 g L -1 的模擬血漿樣品, 每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析。同時(shí), 另取空白血漿500 L, 除不加標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外, 其他按%2 3&條方法操作, 殘留物以相應(yīng)濃度的氯雷他定標(biāo)準(zhǔn)R SD/%-23 結(jié)果3 1 方法的專屬性分別取6名受試者的空白血漿500 L, 按%2 3&條(不加內(nèi)標(biāo)溶液 操作, 進(jìn)樣20 L, 得色/( g L -1A dded 1. 005. 0016. 00Found 1. 004. 7816. 60Table

13、1 Accuracy and precision for the analysis of loratadine (in prestudy validation, n =18Relativeerr or/%0. 4-4. 33. 9Intra day 10. 56. 47. 5Inter day 14. 110. 07. 8A Blank plasma sample; B LL OQ of loratadine (0. 5 g L -1 ; C Plasma spiked with 20 g L -1loratadi ne and 400 g L -1IS; D Plasma sample 1.

14、 0h after an oral dose of 20mg loratadine to a healthy volunteer; Peak (L oratadine; Peak ISFig. 1 Typical chromatogram s of loratadine and diazepam (IS by selected ion m onitoring (SIM scan mode系列溶液溶解, 進(jìn)樣分析, 獲得相應(yīng)峰面積(3次測(cè)定的平均值 。氯雷他定在1 0、5 0、16 0 g L -161 2%、67 8%、67 3%, 內(nèi)標(biāo)提取回收率60 9%。作者考察了氯雷他定血漿樣品室溫放置

15、24h, 血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍解凍循環(huán)以及3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品提取回收率分別為-20#冷凍45d 的穩(wěn)定性。結(jié)果表明氯雷他定血漿樣品的穩(wěn)定性合乎要求。3 5 血藥濃度時(shí)間曲線受試者口服氯雷他定受試制劑和參比制劑20mg 后, 平均血藥質(zhì)量濃度時(shí)間曲線見圖2。3 6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)3p97程序處理, 18名受試者主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。以AUC 0t 計(jì)算, 氯雷他定的相對(duì)生物利用度平均為(113 4 19 0 %。3 7 生物等效性研究對(duì)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析, 并進(jìn)一步采用雙單側(cè)t 檢驗(yàn)和(1-2 置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià), 其中t max 采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。數(shù)據(jù)表明

16、:氯雷他定的AUC 0-t 和 max 均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑中, 氯雷他定AU C 0-t 的90%置信區(qū)間為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的92 6%118 9%, m a x 的90%置信區(qū)間為參P ar ameterAU C 0t /( g h L -1 AU C 0t max /h t 1/2/h F /%,比制劑相應(yīng)參數(shù)的84 9%107 3%。t max 的非參數(shù)法檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩制劑無顯著性差異。根據(jù)以上結(jié)果, 判定兩制劑生物等效。T est;+ReferenceFig. 2 Mean plasma concentration time curve of loratadine afte

17、r a single oral dose of 20mg loratadine of different for mulations in 18volunteersTable 2 Mean pharmacokinetic parameters of loratadine after a single oral dose of 20mg loratadineT est formulation 43. 67 9. 5552. 11 13. 0416. 45 2. 420. 94 0. 218. 89 4. 06113. 4 19. 0Reference formulation38. 70 6. 9

18、347. 84 9. 0816. 41 2. 830. 94 0. 219. 56 4. 21/( g h L -1max /( g L -14 討論有關(guān)血漿中氯雷他定的測(cè)定方法國內(nèi)外均有報(bào)道, 包括熒光檢測(cè)法2應(yīng)引起注意。參考文獻(xiàn):1鐘大放. 以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題J.藥物分析雜志, 1996, 16(5 :343-346.2徐曉杰, 尚爾鑫, 裘福榮, 等. 氯雷他定血藥濃度的HPLC 熒光檢測(cè)法及生物等效性研究J. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 39(2 :123-126.3阮鄒榮, 袁虹, 孫凌. 反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中氯雷他定濃度J. 藥物分析雜志, 200

19、2, 22(4 :296-298.4M artens J. Determination of loratadine and pheniraminefrom human serum by gas chromatog raphy mass spec trometr y J .J Chromatogr B, 1995, 673(2 :183-188.5Chen J, Zha YZ, Gao K P, et al . A validated HPLC ESIM S method for the deter mination of loratadine in human plasma and its a

20、pplicatio n to pharmaco kinetic studies J. Pharmazie, 2004, 59(8 :600-603.、高效液相色譜法3、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法4和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法5, 6等。作者采用H PLC M S 法測(cè)定血漿中氯雷他定的質(zhì)量濃度, 與文獻(xiàn)相比, 本法分析時(shí)間短, 3 5m in 之內(nèi)即完成一次測(cè)定, 均優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的方法, 分析速度快, 效率高, 適于大批量血樣的測(cè)定。同時(shí)血漿樣品預(yù)處理采用液液萃取法, 操作簡便快速。因此, 該法適于氯雷他定的藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出, 氯雷他定生物利用度個(gè)體差異較大, 文獻(xiàn)2報(bào)道可能原因

21、為人體內(nèi)氯雷他定在細(xì)胞色素P450酶系3A4和2D6酶作用下轉(zhuǎn)化為去乙氧?；壤姿?descar boethoxyloratadine , 而此兩種酶活性存在較大的個(gè)體差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)一致, 提示臨床用藥6Sun JG , W ang GJ, W ang W, et al . Simultaneous determination of loratadine and pseudoephedrine sulfate in human plasma by liquid chromatography -electrospr aymass spectrometry for pharmacokine

22、t ic studies J. J Pharm Biomed Anal, 2005, 39(1-2 :217-224.Determination of loratadine in human plasma and its bioequivalence by HPLC/MS methodLI Dan yi, CHEN Xiao hui, BI Kai shun(School of Pharmacy , Shenyang Phar maceutical University , Shenyang 110016, ChinaAbstract:Objective To develop a sensit

23、ive and specific LC/MS method for direct determ ination of lorata dine in human plasma and study the bioequivalence of different formulations containing loratadine. Methods After a sing le dose oral administration of loratadine 20m g to 18healthy Chinese m ale volunteers, the plasma concentrations o

24、f loratadine w ere determined. Loratadine and internal standard diazepam w ere extracted from plasma using liquid liquid extraction. Plasma concentration of loratadine was determined by H PLC M S, and the pharmacokinetic parameters of loratadine in different form ulations w ere calculated. Results T

25、he linear calibration curves w ere obtained in the concentration range of 0. 520. 0 g L -1. The limit of quan tity w as 0. 5 g L . Pharmacokinetic parameters of loratadine reference formulation was obtained as fol-1lows:t max w as (0. 94 0. 21 h, , t 1/2w as (9. 56 4. 21 h, AU C 0 t was m a x w as (16. 41 2. 83 g L (38. 70 6. 93 g h L -1, pharmacokinetic parameters of loratadine test formulation w as obtained as fol-1lows:t max w as (0. 94 0. 21 h,