食管內臟高敏感性動物模型的建立和評價

1、食管內臟高敏感性動物模型的建立和評價    【摘要】  目的 建立食管內臟高敏感性動物模型。方法 采用腹腔注射雞卵清蛋白（OVA）基礎致敏聯合食管酸灌注的方法處理SD大鼠，并采用免疫組織化學方法和顯微圖像分析技術評價內臟高敏感性-食管化學刺激大鼠模型的可靠性。 結果 OVA基礎致敏聯合食管酸灌注組大鼠被激活了一個復雜而廣泛的大腦網絡，其在額頂皮質、島葉、扣帶皮質、中央杏仁核、K?lliker-Fuse核、疑核、臂旁核、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、三叉旁核、孤束核、最后區(qū)、延髓網狀核等Fos樣免疫活性（FLI）神經元的數目均顯著高于其余各組（P0.

2、05）。模型組大鼠在中央杏仁核、臂旁核、室旁核、三叉旁核、孤束核的FLI陽性產物的平均光密度 (OD) 值亦較其余各組明顯增高（P0.05）。結論 預先腹腔注射雞卵清蛋白基礎致敏聯合食管酸灌注可成功建立食管內臟高敏感性動物模型。 【關鍵詞】  內臟高敏感性；c-fos；免疫組織化學；食管酸灌注；卵清蛋白基金項目 國家自然科學基金資助項目（30700362）Establish and evaluation of the rat model of esophageal visceral hypersensitivityAbstract: Objective   To

3、establish a reliable rat model of esophageal visceral hypersensitivity. Methods   Healthy Sprague-Dawley (SD) rats received basal ovalbumin-sensitized combined with intra-esophageal mucosal acid exposure. The neuronal expressions of c-fos proto-oncogene were detected with immunohistochemic

4、al counter-staining and computerized color image analyzer. Results   The basic ovalbumin-sensitized plus esophageal acid perfusion in model group initiated a high density expression of c-fos-immunoreactive (Fos-IR) neurons in multineuronal networks. A significantly higher number of Fos pos

5、itive neurons was found in the model group than those in the corresponding regions of other groups（P0.05）in the following brain areas: frontal and parietal cortex, insular cortex, cingulated cortex, central amygdaloid nucleus,the K?lliker-Fuse nucleus, the nucleus ambiguus, parabrachial nucleus, hyp

6、othalamic paraventricular nucleus, paraventricular thalamic nucleus, paratrigeminal nucleus, the nucleus of solitary tract, area postrema, reticular nucleus of medulla,The OD values of Fos-IR neurons were also increased in the central amygdala , parabrachial nucleus, paraventricular nucleus, the par

7、atrigeminal nucleus and NTS in the model group than that in the corresponding regions of other groups（P0.05）.Conclusion   The reliable rat model of esophageal visceral hypersensitivity has been established.    Keywords: visceral hypersensitivity; c-fos; immunohistochemistry;

8、 esophageal acid perfusion; ovalbumin慢性食管內臟高敏感性可能是某一亞類的非糜爛性反流病(NERD)發(fā)生的最重要病理生理特征，是這類患者癥狀產生的基礎和癥狀多樣化的原因1-2。目前，尚不清楚中樞神經系統(tǒng)(CNS)中哪些核團及環(huán)路參與了食管內臟高敏感性的應答和調節(jié)，亦不明了在內臟高敏感狀態(tài)下哪些結構對食管化學刺激反應敏銳，且在人體開展CNS內形態(tài)學-功能的定位研究非常困難。因此，采用有效的動物模型來研究內臟敏感性改變的中樞敏化機制有著十分重要的意義。1  材料與方法1.1  實驗動物及分組     成年健康SD

9、大鼠29只，雌雄不限，體質量225285 g，由本校實驗動物中心提供。將SD大鼠隨機分為組，A組：空白對照組6只；組：食管酸灌注組8只；組：OVA致敏組7只；組：OVA及食管酸灌注組8只。1.2  方法1.2.1  食管酸灌注的方法    在實驗的第14天，對C組、D組動物進行食管酸灌注。麻醉動物平臥位固定，頭部抬高20°30°，切開腹壁和胃壁，將一引流管放置在賁門處以收集從食管滴注的液體。把一單腔灌流管經口放置于食管內，導管開口位于食管和胃交界處上23 cm，固定導管，另一端與持續(xù)灌注泵相連。使用0.1 mol/L鹽酸滴注

10、，滴注液溫度保持37 ，速度10 mL/h，共50 min。1.2.2  腦組織切片的制備    食管酸灌注后30 min深度麻醉動物后立即開胸，經左心室至升主動脈插管并加壓灌注200 mL生理鹽水沖洗全身血液，隨后用預冷的4 含4%多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)500 mL加壓灌注固定1 h。然后取脊髓和全腦組織置于相同固定液中，在4 條件下固定1820 h，再移至含20蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中浸泡過夜至下沉（4 ）。用恒冷箱冰凍切片機-20 行連續(xù)冠狀切片，片厚40 m，隔5取2，切片貼于經APES處理的載

11、玻片上備用。1.2.3  Fos表達的免疫組織化學染色    用含0.01 mol/L正常小牛血清、0.5% Triton X的PBS液室溫下孵育2 h；滴加兔多克隆抗c-fos抗體稀釋液（12 000，Oncogen公司），4 孵育48 ；滴加二抗，SuperPicTure即用型二步法檢測試劑盒（由上海藍創(chuàng)生物公司提供）在37 孵育1015 min；DAB/H2O2法呈色；最后進行常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片、光鏡觀察。1.2.4  Fos陽性細胞計數方法    用日本Olympus BX-50光學顯微鏡觀察，然

12、后用江蘇捷達科技提供的顯微圖像分析系統(tǒng)處理并計算出各腦區(qū)及神經核團內Fos蛋白陽性細胞數量的總和。1.2.5  數據處理    應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，采用方差分析比較各組間數值差異顯著性，P0.05有顯著性差異。2  結果    各組CNS內FLI神經元計數，從表1可看出：B組大鼠的中央杏仁核、KF核群、下丘腦室旁核、下丘腦視上核、丘腦室旁核、臂旁核、疑核、三叉旁核、孤束核中央亞核和最后區(qū)等核團陽性細胞數量與對照組相比較有統(tǒng)計學意義（見表1，P0.05），而額頂葉皮質則僅有少數FLI顆粒。C組在額葉皮質、區(qū)

13、、扣帶回皮質、區(qū)，及中央杏仁核、下丘腦室旁核、中腦導水管周圍灰質、中尾段延髓的孤束核內側亞核背側和最后區(qū)內有中等密度的Fos陽性神經元表達，且與空白對照組相比有統(tǒng)計學意義。D組大鼠額頂葉皮質(圖1)、島葉、扣帶回、中央杏仁核、KF核群、疑核、臂旁核、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、三叉旁核、孤束核、最后區(qū)、延髓網狀核等核團(圖2)FLI神經元的數目較單純的食管酸灌注組和OVA致敏組顯著增加（P0.05）。 表1  四組大鼠不同腦區(qū)和核團Fos陽性神經元的數量比較（略）*：與A組比較，P0.05；#：與A組比較，P0.05；:B組和C組比較，P0.01a:×40; b:×

14、200; :棕褐色顆粒為核染色陽性細胞圖1  OVA致敏聯合食管酸灌注大鼠前額葉皮質Fos表達（略）a:×40; b:×100; :棕褐色顆粒為核染色陽性細胞圖2  OVA致敏聯合食管酸灌注大鼠在延髓內臟帶內有Fos密集分布（略）3  討論    本研究采用預先腹腔注射卵清蛋白基礎致敏后再進行食管酸灌注的方法來制備食管內臟高敏感性大鼠模型，并采用免疫組織化學方法評估模型可靠性。c-fos原癌基因及其編碼的相關蛋白可作為研究神經傳導通路或腦的功能活動的一個有意義的標志物，亦可作為中樞神經對傷害性刺激反應的疼痛標志物，

15、可用來判斷、追蹤傷害性刺激信號的傳導通路，其表達部位常常是與傷害性信息傳遞、中繼或整合有關的區(qū)域。c-fos還可以作為第三信使接受細胞外刺激的短程信息，進而導致細胞功能變化，因而c-fos在神經系統(tǒng)可塑性方面扮演著重要的角色3-4。近年來在神經系統(tǒng)形態(tài)定位和功能活動相結合的研究中得到了廣泛應用，已在內臟痛覺過敏的神經機制的研究中得到應用5-7。Fos蛋白形態(tài)學顯示方法的建立也為研究感覺刺激信息的傳導通路提供了一個快捷、敏感和方便的研究手段。雖然結果是通過形態(tài)學方法顯示，但在某種程度上反映了一定的功能意義，是一種形態(tài)學和功能學相結合的指標。    作者發(fā)現，預先腹腔

16、注射卵清蛋白基礎致敏后再進行食管酸灌注激活了一個復雜而廣泛的大腦網絡，CNS內從皮質至延髓有廣泛的Fos蛋白表達，且在多個部位Fos陽性細胞數目比單純的食管酸灌注組或卵清蛋白致敏組明顯增多并集中分布，且所激活的腦區(qū)更多，多數為深染。這表明卵清蛋白基礎致敏對食管酸灌注誘發(fā)的CNS內Fos表達有活化作用，增加了多個腦區(qū)的FLI神經元細胞數和增強c-fos基因表達的強度。此項結果表明慢性的內臟高敏感狀態(tài)可能易化了某種痛覺傳遞過程并促進了食管內臟的痛覺過敏形成，并由此導致CNS疼痛“標志物”Fos蛋白表達的增強，也提示采用腹腔注射雞卵清蛋白致敏聯合食管酸灌注來制備內臟高敏感性大鼠模型是可行和成功的。【

17、參考文獻】  1 Hong SJ，Ko BM，Jung IS，et al.Relevance of ineffective esophageal motility and hyperactive acid sensitization in patients with gastroesophageal refluxJ.J Gastroenterol Hepatol，2007,22(10):1662-1665.2 Ringel Y.New directions in brain imaging research in functional gastrointestinal disorde

18、rsJ.Dig Dis，2006,24(3-4):278-285.3 Song GH,Venkatraman V,Ho KY,et al.Cortical effects of anticipation and endogenous modulation of visceral pain assessed by functional brain MRI in irritable bowel syndrome patients and healthy controlsJ.Pain，2006，126(1-3):79-90.4 Hobson AR,Furlong PL,Worthen SF,et al.Real-time imaging of human cortical activity evo