肺炎鏈球菌莢膜缺陷菌株的構(gòu)建及功能研究

1、肺炎鏈球菌莢膜缺陷菌株的構(gòu)建及功能研究         08-10-16 13:14:00     編輯：studa20                作者：孟江萍，尹一兵，袁軍，張雪梅，藍鍇，陳淑惠，王虹，涂植光 【Abstract】AIM：To construct galU-deletion mutant of strept

2、ococcus pneumoniae and get the capsule deficient strain, which can be used in pneumococcal functional genome research. METHODS:  LFHPCR was introduced to generate a gene disruption construct consisting of Emr cassette with long flanking homology regions to the target gene. The streptococcus pne

3、umoniae was then transformed directly with this PCR product. The galUdeletion mutant was obtained on the TSA agar containing erythromycin and identified by PCR. The deficient strain (5×106 CFU) was applied to infect BALB/c mice to determine the virulence. RESULTS:  GalU gene was replaced c

4、ompletely by erm cassette. The mutant had low virulence to BALB/c mice. CONCLUSION:  The galUdeletion mutant can be used to screen in vivopromoter in streptococcus pneumoniae because it is incapable of synthesizing capsular polysaccharide and hence loses virulence. The target gene can be replac

5、ed completely by LFHPCR product, so this method is simple, rapid and effective for functional genome research of streptococcus pneumoniae.【Keywords】  streptococcus pneumoniae；polysaccharides ,bacterial；mutation；polymerase chain reaction【摘要】目的：  galU基因是肺炎鏈球菌莢膜合成的關(guān)鍵基因，構(gòu)建該基因的缺失突變體，獲得肺炎鏈球菌莢膜缺陷

6、菌株，研究其生物學功能，并為肺炎鏈球菌功能基因組研究提供實驗菌株和技術(shù)平臺. 方法： 采用長臂同源多聚酶鏈式反應（LFHPCR）方法制備中間為紅霉素耐藥基因（erm），兩側(cè)為galU基因上、下游同源序列的連接片段，并將此片段轉(zhuǎn)化入肺炎鏈球菌，在含紅霉素的血平板上篩選出缺陷菌株.用PCR鑒定缺陷菌株，小鼠實驗研究其毒力.結(jié)果： PCR結(jié)果顯示galU基因完全被erm基因所替代，小鼠毒力實驗表明缺陷菌株毒力顯著下降.結(jié)論： galU缺失突變體在小鼠體內(nèi)不能形成莢膜導致其難以在小鼠體內(nèi)存活，可作為篩選肺炎鏈球菌體內(nèi)誘導啟動子的宿主菌.用LFHPCR作基因突變，可完全替代靶基因，簡便、快速，是肺炎鏈球

7、菌功能基因組研究的一種有效的方法.【關(guān)鍵詞】 鏈球菌，肺炎；多糖類，細菌；突變；聚合酶鏈反應0引言肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae,S.pn）是一種常見的條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等嚴重疾病.莢膜多糖的合成是一個多基因參與的過程，S.pn染色體上有關(guān)莢膜合成的基因位于dexB 和 aliA 基因的之間，形成操縱子結(jié)構(gòu)（cap operon），參與型特異性莢膜的合成（據(jù)此可將S.pn分為90多個血清型），但是在莢膜操縱子外還存在一些基因?qū)ηv膜的合成非常重要1.有研究表明在所有S.pn中都存在galU基因，其編碼的UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG：P

8、P）是莢膜多糖生物合成過程中的關(guān)鍵酶2.研究證實肺炎鏈球菌galU基因不是細菌生存所必需的基因3，為可以成功構(gòu)建其突變株提供了理論依據(jù).基因缺失技術(shù)是目前研究基因功能的最佳方法，這里我們采用基于LFHPCR（long flanking homology polymerase chain reaction）方法失活肺炎鏈球菌galU基因，從而獲得S.pn莢膜缺陷菌株，并對該突變株進行初步的研究.1材料和方法11材料S.pn血清3型CMCC 31203購自中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學微生物菌種保存中心.培養(yǎng)基： C+Y半合成培養(yǎng)基，含5 g/L Yeast提取物（lacks and hotchkis

9、s，1960）；TSA血平板，含50 mL/L兔脫纖維全血.雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量1822 g，購自第三軍醫(yī)大學動物中心.S.pn CPM8染色體DNA（含有紅霉素抗性基因erm）、感受肽刺激肽（CSP），由美國Morrison DA教授惠贈.膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司.PCR試劑購自上海生物工程技術(shù)服務有限公司.引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成，序列如下：PrimerSequence 53P1GTTGAAACTGCTGGTGCTCTTAAP2TGCTTTCACTTTATTATCTTGGP3ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGTCCGTGATAAATAACT

10、TGGTAAP4TCGTTAAGGGATCAACTTTGGGATTTTCTTTCAACTTCGTCACATDAM212CCGGGCCCAAAATTTGTTTGATDAM213AGTCGGCAGCGACTCATAGAATGP1CCCTCTAGAGAAAGGATTTTTATGAGP2TTTGGATCCTTATCTTTTTATTTTATTC12方法121S.pn 31203菌株制備按S.pn基因組DNA經(jīng)典提取方法4制備： S.pn 31203菌株基因組DNA.122連接片段的制備首先用PCR分別擴增出galU基因的上（P1，P3）、下游片段（P4，P2）和erm基因，引物P3、P4分別帶有2223

11、個與erm基因5，3端兩側(cè)互補的堿基，這樣擴增出的上、下游片段就分別帶有一段與erm基因互補的序列；膠回收3個片段，并定量；再通過PCR用外側(cè)引物（P1，P2）將這3個片段連接起來.膠回收連接片段，一份用于轉(zhuǎn)化，一份送生工測序部測序.123S.pn實驗室轉(zhuǎn)化取-70保存的31203菌株500 L培養(yǎng)于CTM培養(yǎng)基（10 mL C+Y中含1 mmol/L的CaCl2和2 g/L BSA）中，當細菌達到一定菌密度時（A550nm=009），加入CSP和連接片段，37孵育90 min，然后鋪于含紅霉素（025 mg/L）的TSA上，37孵箱培養(yǎng)2448 h，挑取血平板上的轉(zhuǎn)化菌落，于含紅霉素（025 mg/L）的C+Y中增菌，保存并提取DNA.124缺陷菌株的PCR鑒定分別以20