端粒酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)

1、端粒酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)作者：鄧志華 楊長(zhǎng)青 劉燕 劉金龍 楊強(qiáng) 趙婕 韓子巖 曹燕 作者單位：030002 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化科【摘要】 目的 研究端粒酶反義寡核苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。方法 以人肝癌細(xì)胞株 SMMC7721、正常肝細(xì)胞株 L02 為研究對(duì)象，采用TRAPELISA 法對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性進(jìn)行定性定量分析；細(xì)胞形態(tài)學(xué)、TUNEL染色、DNA 瓊脂糖凝膠電泳觀察端粒酶反義寡核苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行時(shí)相分析，Western 雜交對(duì)細(xì)胞周期蛋白進(jìn)行研究。結(jié)果 一定濃度的端粒酶反義寡核苷酸可抑制肝癌細(xì)胞端粒

2、酶活性，肝癌細(xì)胞端粒酶活性被抑制后傳代 2326 次出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期蛋白有關(guān)。結(jié)論 端粒酶反義寡核苷酸可抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性并誘導(dǎo)其凋亡。【關(guān)鍵詞】 端粒酶 肝癌 反義寡核苷酸 細(xì)胞凋亡0 引言我國(guó)為肝癌高發(fā)國(guó)家，據(jù)統(tǒng)計(jì)肝癌位居男性腫瘤患者死亡原因的第二位1。肝癌的發(fā)生發(fā)展與端粒酶激活密切相關(guān)。端粒酶由三部分組成，即端粒酶 RNA、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和端粒酶相關(guān)蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色體末端端粒序列時(shí)必須以自身的 RNA 為模板2。端粒酶 RNA 由 450 個(gè)核苷酸組成，其中 11 個(gè)核苷酸為端粒合成的模板序列。我們?cè)O(shè)想，封閉端粒酶 RNA 的模板序列，干擾端粒酶向染色

3、體末端添加端粒序列的過(guò)程, 使癌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定機(jī)制破壞，就可使永生化細(xì)胞的癌細(xì)胞無(wú)限增殖受限，從根本上抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察靶向端粒酶模板區(qū)的硫代反義寡核苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞端粒酶活性及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為肝癌治療探索一條新的、有效的途徑。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞株 SMMC7721，正常肝細(xì)胞株 L02，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物技術(shù)研究所。1.1.2 TRAP 反應(yīng)試劑、TUNEL 檢測(cè)試劑、Western 單抗為寶靈曼公司產(chǎn)品。1.1.3 聚丙烯酰胺銀染試劑 硝酸銀(AgNO3)，無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)，購(gòu)自華美生物公司。1.1.4 儀器 Be

4、ckman CS15R 低溫離心機(jī)，PerkinElmer gene PCR 儀，MK2 酶標(biāo)儀。1.2 方法1.2.1 端粒酶反義 DNA 的設(shè)計(jì) 選擇近端粒酶 RNA 模板區(qū)的 20 個(gè)核苷酸為反義靶位，設(shè)計(jì)合成端粒酶反義 DNA 序列、正義序列、隨機(jī)序列，見(jiàn)表 1。硫代反義 DNA 由中科院上海細(xì)胞所合成與純化，純度達(dá) 98%以上。表 1 端粒酶模板區(qū)反義、正義及隨機(jī)序列（略）Tab 1 The sequence of sense, antisense and controlscrabled1.2.2 TRAPPCRELISA 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性3。1.2.3 合成 DNA 對(duì)肝癌細(xì)

5、胞端粒酶活性的影響 1106 SMMC7721 培養(yǎng)于Nunclon 24 孔板，培養(yǎng)液 1ml 含 10% 熱滅活小牛血清、50u/ml 青霉素、50g/ml 鏈霉素，培養(yǎng)條件為 37、5% CO2 。正義、隨機(jī)、反義 DNA 終濃度為 10mol/L，以 PBS 為對(duì)照，作用時(shí)間分別為 12、24、36、48、60h，培養(yǎng)結(jié)束后胰酶消化，PBS 洗 2 次，TRAPELISA 法定量測(cè)定端粒酶活性，每一 DNA 設(shè)3 復(fù)孔。進(jìn)一步觀察倍比稀釋后的端粒酶反義 DNA（濃度為 10、5、2.5、1.25mol/L）作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的影響。1.2.4 凋亡研究(1)TUNEL 染色觀

6、察細(xì)胞染色及細(xì)胞調(diào)亡 4105/ml 培養(yǎng)細(xì)胞種植于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，不同寡核苷酸作用 14 天后 PBS 洗滌 2 次進(jìn)行細(xì)胞爬片，按 TUNEL試劑盒說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、標(biāo)記反應(yīng)，蘇木素染色，封片，拍照。(2)流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析 1104 細(xì)胞經(jīng) 5mol/L 反義 DNA 作用 14 天的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期時(shí)相分析。(3)DNA 抽提及電泳 將 1106 經(jīng)反義 DNA 作用 14 天的細(xì)胞移入 1.5ml 離心管，加裂解液及蛋白酶k，55水浴 20min，加 RNA 酶 10l 作用 2min，酚、氯仿異戊醇各抽提 1 次，加 3M 乙酸鈉、無(wú)水乙醇沉淀 DNA，3000g

7、 離心10min，氣干，TE 溶解沉淀。 取抽提好的 DNA 5l，在 1.8%瓊脂糖凝膠、5V/cm 電壓下，電泳 3h，以 Hind 酶切的DNA 為分子標(biāo)志，302nm 紫外光透照并照相。1.2.5 Western 分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 收集經(jīng)反義 DNA 作用 14 天的SMMC7721 肝癌細(xì)胞（以未作任何處理的 SMMC7721 陰性對(duì)照），裂解液裂解，蛋白產(chǎn)物進(jìn)行 SDSPAGE 電泳（15%濃縮膠，5%分離膠），電泳產(chǎn)物半干電轉(zhuǎn)移至 NC 膜上（轉(zhuǎn)移時(shí)間 p21 為 45min，CyclinD1、Cdk2 為 1h），50g/L 脫脂奶粉室溫封閉 4h，TBS 漂洗 3 次，分

8、別加入抗小鼠 CyclinD1，抗兔 Cdk2、p21單克隆抗體及作為內(nèi)參照的actin 單克隆抗體，4過(guò)夜反應(yīng)，TBS 漂洗 3次，再加入相應(yīng)二抗，室溫反應(yīng) 4h，TBS 漂洗 3 次后，DAB 顯色。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法方差分析,P0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 合成反義、正義、隨機(jī)序列 DNA 作用不同時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC7721 端粒酶活性的影響10mol/L 合成端粒酶反義 DNA 對(duì)肝癌細(xì)胞端粒酶活性具有顯著抑制作用，這種抑制作用開(kāi)始于 12h，60h 端粒酶活性被完全抑制，而正義鏈及隨機(jī)鏈對(duì)細(xì)胞端粒酶活性無(wú)顯著影響，見(jiàn)表 2、圖 1。表 2 合成 DNA 對(duì) SM

9、MC7721 細(xì)胞端粒酶活性的影響（110 6/ml）（略）Tab 2 The effection of Synthesised DNA ontelomerase activity（110 6/ml）*：The difference is significant compared to the control，P0.01a:Control scrambled;b:Sense;c: Antisense圖 1 端粒酶反義寡核苷酸對(duì)端粒酶活性的抑制作用（略）Fig 1 The inhibitory effect of antisensetelomeraseoligonucleotide for te

10、lomerase activity2.2 反義寡核苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用2.2.1 TUNEL 標(biāo)記 在倒置顯微鏡下我們觀察反義寡核苷酸作用 14 天的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) 60%的癌細(xì)胞被染成棕色，并有凋亡小體的產(chǎn)生，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于正義序列，見(jiàn)圖 2。a: Antisense light microscope(800)；b: Sense lightmicroscope(400)圖 2 端粒酶反義及正義寡核苷酸作用 14 天 TUNEL 染色（略）Fig 2 TUNEL staining for SMMC7721 after antisense andsensetelomerase oligo

11、nucleotide affected for 14 days2.2.2 DNA 電泳 反義寡核苷酸作用 14 天，光鏡下癌細(xì)胞呈凋亡改變，DNA抽提電泳出現(xiàn)凋亡條帶，見(jiàn)圖 3。a:Genomic;b,c:Antisense;d:Sense圖 3 端粒酶反義寡核苷酸作用 14 天細(xì)胞 DNA 電泳圖（略）Fig 3 The DNA electrophoresis after antisense telomeraseoligonucleotide affected for 14 days2.2.3 端粒酶活性與細(xì)胞周期的關(guān)系 合成 DNA 與 1104/ml 細(xì)胞共育 2周，反義 DNA 在端粒

12、酶活性被抑制后,S 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降,而 G2/M 期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增高，細(xì)胞聚集于 G2/M 期，見(jiàn)表 3。表 3 端粒酶 DNA 對(duì)細(xì)胞周期的影響（n=3）（略）Tab 3 The effection of telomerase DNA on the cell cycle（n=3）*：The difference is significant compared to the control，P0.012.3 細(xì)胞周期調(diào)控因子檢測(cè)結(jié)果反義寡核苷酸作用的肝癌細(xì)胞培養(yǎng) 14 天后收集裂解細(xì)胞總蛋白，以actin 作內(nèi)對(duì)照，Western blot 技術(shù)檢測(cè) CyclinD1(細(xì)胞周期素)、Cdk2(

13、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶)和 p21（細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子）的表達(dá)，結(jié)果顯示在actin 等量的情況下，與正義序列比較反義寡核苷酸作用的肝癌細(xì)胞 CyclinD1、Cdk2 的表達(dá)下降而 p21 蛋白的表達(dá)顯著增加，見(jiàn)圖 4。圖 4 端粒酶反義 DNA 作用后 SMMC7721 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)（略）Fig 4 The expression of cell Cyclin aftertelomeraseantisenseDNA affected3 討論我國(guó)為病毒性肝炎高發(fā)國(guó)家，病毒性肝炎相關(guān)肝硬化、肝癌的發(fā)生率居高不下。病毒感染可造成肝細(xì)胞變性壞死、假小葉形成。肝細(xì)胞在不斷壞死及增

14、殖過(guò)程中與病毒核酸整合而造成肝細(xì)胞端粒酶激活、無(wú)限增殖、永生化而惡變。因此，端粒酶激活在肝細(xì)胞癌變及其惡性增殖中起決定性作用4。端粒酶是核糖核蛋白復(fù)合體，主要功能是向分裂細(xì)胞染色體末端添加端粒重復(fù)序列以保證腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖。腫瘤細(xì)胞因端粒酶激活而惡性增殖，因此，用反義核酸來(lái)抑制或消除腫瘤細(xì)胞端粒酶活性成為近年腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，核酸類藥物抗腫瘤具有廣泛臨床應(yīng)用前景5。研究指出：在寡脫氧核苷酸上通過(guò)共價(jià)連接引入一定的活性基團(tuán)，可使該寡核苷酸耦合物除具有一般寡核苷酸特性外，其耐核酸酶能力、與靶核酸分子結(jié)合的強(qiáng)度及細(xì)胞對(duì)寡核苷酸攝取等均顯著增強(qiáng)6， 修飾的寡核苷酸被認(rèn)為是選擇性抑制基因表達(dá)的新工具

15、和抗腫瘤治療最有前途的新藥。我們對(duì)靶向端粒酶模板區(qū)的反義 DNA 的研究發(fā)現(xiàn)：反義 DNA 能識(shí)別并與端粒酶模板 RNA 結(jié)合而抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，端粒酶活性的下降具有濃度依賴性，10mol/L 的反義 DNA 作用 12h 即開(kāi)始產(chǎn)生抑制作用，繼續(xù)作用 60h 端粒酶活性幾乎完全被抑制，實(shí)驗(yàn)中反義 DNA 作用的時(shí)間延擱為 12h，可能與其進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程有關(guān)7。隨著肝癌細(xì)胞端粒酶活性的被抑制，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯，因此，端粒酶反義 DNA 抑制腫瘤細(xì)胞增殖是通過(guò)抑制其端粒酶活性實(shí)現(xiàn)的。肝癌細(xì)胞端粒酶活性的抑制，意味著癌細(xì)胞失去了賴以永生化的物質(zhì)基礎(chǔ)而轉(zhuǎn)為“非永生化”。凋亡研究結(jié)果顯示:端

16、粒酶失活的癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞活力顯著下降并出現(xiàn)調(diào)亡。端粒酶反義 DNA 與肝癌細(xì)胞共育 14 天后，TUNEL 染色 60%的癌細(xì)胞被染成棕色，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)核深染、染色質(zhì)邊集、核碎裂及凋亡小體形成；細(xì)胞DNA 電泳呈凋亡特征性 Ladder，流式細(xì)胞儀研究顯示 S 期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著下降，說(shuō)明發(fā)生凋亡的細(xì)胞為處于細(xì)胞周期 S 期的細(xì)胞8。Western 雜交結(jié)果顯示反義 DNA 作用的肝癌細(xì)胞 Cdk2、CyclinD1 的表達(dá)量下調(diào)而 p21 表達(dá)增加。這就意味著端粒酶反義 DNA 通過(guò)對(duì)端粒酶活性的抑制而影響了細(xì)胞 p21 的表達(dá)。有研究表明細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制的破壞可導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定和

17、基因突變，腫瘤細(xì)胞 CyclinD1 的過(guò)度表達(dá)可縮短腫瘤細(xì)胞 G1 期使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，而 p21 的高表達(dá)則抑制腫瘤增殖并促進(jìn)其發(fā)生分化9， p21能與 Cdk2 結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止其與 CyclinD1 的結(jié)合。我們所合成的端粒酶反義 DNA 有可能通過(guò)細(xì)胞周期因子 CyclinD1、Cdk2 和 p21 的調(diào)控來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖。端粒酶反義 DNA 分子特異地與細(xì)胞內(nèi)端粒酶 RNA 結(jié)合，但對(duì)染色體端粒酶基因并無(wú)封閉作用，因此，反義 DNA 對(duì)端粒酶活性的抑制是可逆的。我們將去除反義分子的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 20 天，端粒酶弱表達(dá)且不能恢復(fù)到原來(lái)的水平，發(fā)生這種現(xiàn)象的原因可能與下列因

18、素有關(guān)：（1）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的反義 DNA 有足夠量結(jié)合新轉(zhuǎn)錄的端粒酶 RNA 模板序列；（2）端粒酶發(fā)揮作用必須以全酶的形式，端粒酶蛋白質(zhì)成分在端粒酶活性調(diào)控中起主要作用，反義分子與端粒酶 RNA 結(jié)合后可影響其蛋白質(zhì)亞單位的構(gòu)象或功能而影響端粒酶活性，即使細(xì)胞端粒酶RNA 基因有轉(zhuǎn)錄，其蛋白質(zhì)成分也不能發(fā)揮作用；（3）端粒酶在細(xì)胞內(nèi)被滅活后, 腫瘤細(xì)胞自身也發(fā)生了一系列的變化，如分化、老化及凋亡，端粒酶活性均顯著降低10?？傊覀兊难芯勘砻?，端粒酶反義 DNA 能抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，并通過(guò)此途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖、使 S 期細(xì)胞凋亡。靶向端粒酶的核酸類藥物有潛在臨床應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究

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