高效液相色譜法測定氨基酸

1、 腦蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 （生產(chǎn)企業(yè)：湖南利諾生物藥業(yè)有限公司）腦蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案1、儀器與試藥1.1 儀器1525型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型檢測器，Waters5CH型柱溫箱，WatersBREEZE數(shù)據(jù)處理軟件，水浴恒溫器（精度±0.1），旋渦器，微量移液器，衍生專用管；CP225D型分析天平（德國）；4umNora-PakTMC18（3.9mm×150mm，5m）色譜柱（美國）1.2 藥品與試劑16種氨基酸（門冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨

2、酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中國藥品生物制品檢定所提供。腦蛋白水解物注射液，云南盟生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格10ml/支。批號(hào)：2013、2013、2013.乙腈（HPLC級(jí)）；EDTA（分析純）；磷酸（分析純）；二乙胺（分析純）；三水合乙酸鈉（分析純）。2、方法與結(jié)果2.1 色譜條件 流動(dòng)相A為AccQTag醋酸磷酸鹽緩沖液；由AccQTagEluent A濃縮制備AccQTag洗脫液,用前稀釋10倍（或按以下方法配制：稱19.04g三水合乙酸鈉，加1000ml純化水，攪拌，溶解，用50%H3PO4將pH調(diào)至5.2，加入1ml 1mg/m

3、l的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性過濾器過濾，超聲，脫氣，備用。）；流動(dòng)相B為60% HPLC級(jí)乙腈，按梯度表梯度洗脫；流速1.0ml/min；檢測波長為254nm；進(jìn)樣量5l；柱溫38。時(shí)間 (min)流速 (ml/min)% A% B曲線起始1.01000*0.51.0982615.01.0937619.01.09010632.01.06535633.01.06535634.01.00100637.01.00100638.01.01000642.01.0100062.2 對照品溶液、供試品溶液的制備 分別精密稱取16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用純

4、化水配制成濃度如下表所示的混合溶液。名稱濃度（mg/ml）名稱濃度（mg/ml）名稱濃度（mg/ml）門冬氨酸4.80蘇氨酸1.20異亮氨酸1.10絲氨酸2.60丙氨酸2.50亮氨酸2.70谷氨酸6.20脯氨酸2.00苯丙氨酸1.20甘氨酸2.40纈氨酸1.60色氨酸0.40組氨酸0.90甲硫氨酸1.00精氨酸1.20賴氨酸3.45取上述溶液0.1ml，加純化水0.9ml，旋渦器混勻，作為對照品溶液；取腦蛋白水解物注射液，加水稀釋成含總氮為1mg/ml的溶液，取0.1ml，加純化水0.9ml,旋渦器混勻，作為供試品溶液。衍生劑配制 將水浴鍋設(shè)置55，加熱，待溫度穩(wěn)定, 取AccQFluor衍生

5、劑2A，輕輕彈擊,確保AccQFluor衍生劑2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀釋劑2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor衍生稀釋劑2B 1ml，加入AccQFluor衍生劑2A的瓶中，振蕩10秒鐘，在恒溫水浴鍋中溶解，保持10分鐘。于干燥器中室溫保存一周,于干燥器中4保存二周。2.3 測定方法 分別取20ul對照品溶液和供試品溶液加入衍生專用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸緩沖液旋渦混勻，邊混勻邊加入20ul衍生劑，封口放置1分鐘，放入55恒溫水浴鍋中保溫10分鐘，取衍生的對照溶液及供試品溶液各5ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算

6、每1mg（以總氮量計(jì)）中氨基酸含量。2.4 準(zhǔn)確度 精密稱取16氨基酸分別配制成3個(gè)濃度級(jí)別的溶液，每個(gè)濃度3個(gè)樣品依法測定，計(jì)算測定回收率。2.5 精密度試驗(yàn) 2.5.1系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 取同一濃度樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積與保留時(shí)間并計(jì)算RSD值（RSD2.0%）。2.5.2方法精密度試驗(yàn) 平行制備6份樣品，分別檢測，記錄峰面積與保留時(shí)間并計(jì)算RSD值（RSD2.0%）。2.6 專屬性試驗(yàn) 取已知濃度樣品檢測，標(biāo)明各成分在圖中的位置，要求各成分基本分離。2.7 線性考察試驗(yàn) 精密稱取16種氨基酸對照品制備成5份濃度不同的供試液，按照檢測方法檢測，以測得的峰面積作為被測物濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。求其回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。2.8 范圍 取三批樣品依法檢測含量，應(yīng)為測試濃度的80%120%。2.9耐用性試驗(yàn)2.9