丙型肝炎病毒不同片段抗體蛋白芯片的制備及評價

1、丙型肝炎病毒不同片段抗體蛋白芯片的制備及評價    作者：何謙，楚雍烈，林聯(lián)成，王香玲，劉余靜    【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒    Preparation and evaluation of proteinchip for different HCV antibody detection 【Abstract】 AIM: To prepare and evaluate the clinical application of proteinchip for different he

2、patitis virus C (HCV) antibodies. METHODS: Proteinchip for different HCV antibodies was established by coating chimeric antigen and the 4 segments of HCV antigens on the slide. The results of this method were compared with those of RIBA and ELISA. RESULTS: The negative result and the positive result

3、 of proteinchips of chimeric antigen accorded with ELISA were 93.8 % and 97.1%, respectively. When it came to RIBA, the accordance rate was 96.9 % and 98.5%, respectively. The accordance rates of negative and positive results of proteinchip of the 4 segments of HCV antigens with ELISA were 96.8% and

4、 97.1%, respectively, while they turned out to be 100% and 98.5% with RIBA. CONCLUSION: The proteinchip for different HCV antibodies has a high accordance rate with RIBA（P<0.05）. Proteinchip for different HCV antibodies has high accuracy and can decrease the false positive rate. 【Keywords】 hepaci

5、virus; protein array analysis; antibodies 【摘要】 目的： 制備丙型肝炎病毒（hepatitis virus C, HCV）不同片段抗體蛋白芯片，并對其臨床應(yīng)用價值進(jìn)行評價. 方法： 分別取HCV融合抗原及分片段抗原，點至醛基化玻片上，制成HCV不同片段抗體蛋白芯片. 進(jìn)行抗HCV（ELISA）試劑和RIBA試劑與蛋白芯片法的比較. 結(jié)果： 蛋白芯片的融合抗原檢測與ELISA法相比，陰性符合率為93.8 %，陽性符合率為97.1% . 蛋白質(zhì)芯片分片段檢測與ELISA法相比，陰性符合率為96.8 %，陽性符合率為97.1%. 蛋白芯片的融合抗原檢測與R

6、IBA法相比，陰性符合率為96.9% , 陽性符合率為98.5 %. 蛋白芯片分片段檢測與RIBA法相比，陰性符合率為100%, 陽性符合率為98.5%. 結(jié)論： 蛋白芯片法與RIBA試劑檢測結(jié)果相比較，與RIBA試劑有良好的一致性（P<0.05）)，證明其具有良好的檢測準(zhǔn)確率,并可以降低ELISA法的假陽性. 【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒；蛋白質(zhì)陳列分析；抗體 0引言 近年來，丙型肝炎病毒（HCV）不同編碼區(qū)抗體檢測成為一個熱點1，2. 雖然目前國外都用RIBA3.0試劑作為HCV的確認(rèn)試劑，但是其有價格昂貴、操作復(fù)雜等諸多不足. 丙肝患者的確診、獻(xiàn)血員篩選、治療藥物的研發(fā)、患者的追蹤觀察迫切

7、需要更先進(jìn)、更簡便、更廉價的診斷試劑的問世，為此我們進(jìn)行了HCV不同片段抗體蛋白芯片的實驗研究, 獲得了較滿意的結(jié)果. 1材料和方法 1.1材料 美國Cartesian點樣儀；美國ScanArray4000B 掃描儀；基因工程表達(dá)的HCV融合抗原、核心抗原（C區(qū)）、NS4抗原、NS5抗原（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所）；基因工程表達(dá)的NS3抗原C7（日本東燃公司）；CY3抗人IgG 結(jié)合物（美國Sigma 公司）；不同片段抗體標(biāo)準(zhǔn)品由深圳賽爾生物技術(shù)有限公司惠贈；RIBA3.0試劑，載玻片（美國Chiron公司）；抗HCV（ELISA）試劑（上海永華細(xì)胞和基因高技術(shù)分析中心）；血清標(biāo)本99例，均來源于

8、西安交通大學(xué)第一醫(yī)院和第二醫(yī)院門診及住院患者. 1.2方法 1.2.1包被和封閉將融合抗原及各片段抗原配成不同濃度，用點樣儀將其點樣于醛基化玻片上，37溫浴2 h后晾干. 用含100 mL/L 小牛血清的PBS(0.01 mmol/L PBS, pH 7.2) 37封閉2 h，晾干放于4冰箱過夜后備用. 1.2.2檢測取出制備好的芯片，加110倍稀釋血清10 L， 37水浴30 min， PBST（0.01 mmol/L PBS, pH 7.2, 0.5 mL/L Tween 20）洗滌5次，然后加CY3抗人Ig G 結(jié)合物10 L ， 37水浴30 min，PBST洗滌5次后，用ScanAr

9、ray4000B掃描儀掃描. 1.2.3結(jié)果判斷不同片段中有一個陽性判為可疑，兩個或以上片段陽性則判為陽性標(biāo)本.    統(tǒng)計學(xué)處理： 方法準(zhǔn)確性判斷采用Youden指數(shù)，方法一致性判斷采用Kappa值. 2結(jié)果 2.1實驗條件選擇用棋盤滴定法進(jìn)行抗原濃度、樣品稀釋倍數(shù)及CY3抗人Ig G 結(jié)合物濃度的確定. 不同濃度的各片段抗原點樣，測試標(biāo)準(zhǔn)品并與RIBA試劑比較，符合率最高者為點樣濃度. 結(jié)果以融合抗原100 g/L, C區(qū)抗原100 g/L, NS4抗原50 g/L, NS5抗原50 g/L為最佳. 樣品稀釋倍數(shù)以110為宜. CY3抗人Ig G 結(jié)

10、合物濃度測定以1500為最佳濃度. 2.2重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗將上述包被好的蛋白芯片分別置于4冰箱和室溫下貯存7 d和1, 3, 6 mo后取出 ，用上述方法分別檢測20例陽性標(biāo)本和正常對照，結(jié)果與新鮮包被的蛋白芯片一致. 2.3特異性試驗取甲肝抗體陽性、乙肝表面抗體陽性、巨細(xì)胞病毒抗體陽性、類風(fēng)濕因子陽性血清各20份，用本試劑檢測，結(jié)果均為陰性.    2.4不同丙肝抗原片段Cutoff值（S /n ）的確定檢測407例正常人血清，計算每種抗原的平均熒光強(qiáng)度，求得信噪比. 各片段陰性對照的信噪比應(yīng)小于2.5. Cutoff值等于各片段陰性對照平均值加3倍

11、標(biāo)準(zhǔn)差，片段信噪比大于Cutoff值時該片段抗體為陽性（Tab 1）.表1不同丙肝抗原片段的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和Cutoff值（略） 2.5考核評估蛋白芯片各片段檢測與RIBA確證試劑進(jìn)行比較，結(jié)果見Tab 2. 表2HCV蛋白芯片與RIBA各區(qū)段抗體檢出比較（略） 2.6抗HCV（ELISA）試劑和蛋白芯片法的比較抗HCV（ELISA）試劑檢測樣本99例，其中陽性標(biāo)本69例, 陰性30例. 30例抗HCV ELISA 試劑檢出的陰性樣本，蛋白質(zhì)芯片的融合抗原檢測均為陰性，蛋白質(zhì)芯片的分片段檢測均為陰性；69例抗HCV ELISA 試劑檢出的陽性樣本，蛋白質(zhì)芯片的融合抗原檢測檢出陽性67例，陰性2例

12、；蛋白芯片分片段檢測根據(jù)不同片段中有1個陽性判為可疑，2個或2個以上陽性則判為陽性標(biāo)本的判定標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)芯片的分片段檢測檢出陽性67例，陰性1例，可疑標(biāo)本1例. 統(tǒng)計學(xué)分析表明，蛋白芯片的融合抗原檢測與ELISA法相比，陰性符合率為93.8 %，陽性符合率為97.1%, 具有較好的一致性（Kappa 值=0.953, P<0.05）. 蛋白質(zhì)芯片分片段檢測與ELISA法相比，陰性符合率為96.8 %，陽性符合率為97.1%，具有較好的一致性（Kappa 值=0.954, P<0.05）.    2.7RIBA試劑和蛋白芯片法的比較RIBA試劑

13、檢測樣本99例，其中陽性標(biāo)本66例, 陰性31例，可疑標(biāo)本2例. 蛋白質(zhì)芯片的融合抗原檢測檢出陽性67例，陰性32例. 蛋白質(zhì)芯片的分片段檢測檢出陽性67例，陰性31例，可疑標(biāo)本1例. 統(tǒng)計學(xué)分析表明，蛋白芯片的融合抗原檢測與RIBA法相比，陰性符合率為96.9% , 陽性符合率為98.5 %. 具有較好的一致性（Kappa 值=0.955, P<0.05）. 蛋白芯片分片段檢測與RIBA法相比，陰性符合率為100%, 陽性符合率為98.5%，具有較好的一致性（Kappa 值=0.978, P<0.05）. 2.83例不符合樣本的RIBA試劑及PCR檢測對3例不符合樣本的RIBA試

14、劑及PCR檢測結(jié)果見Tab 3.表3不符合樣本3例的檢測結(jié)果（略） 3討論 蛋白芯片是近年伴隨基因芯片發(fā)展起來的一項新技術(shù)3,4，這項技術(shù)是將蛋白質(zhì)的分析微縮到小型芯片上，利用熒光或酶顯色進(jìn)行檢測，并用電腦進(jìn)行分析. 該技術(shù)在對抗原抗體檢測、疾病診斷、藥物開發(fā)等研究方面顯示出快速、高效、高通量處理信息的能力.    我們使用醛基化玻片作為載體，進(jìn)口激光共聚掃描儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度掃描，進(jìn)行了HCV不同片段抗體蛋白芯片的實驗研究, 并用自制的蛋白芯片對99例標(biāo)本進(jìn)行檢測. 蛋白質(zhì)芯片分片段檢測與ELISA法相比，陰性符合率為93.8 %，陽性符合率為97.1%.

15、 此結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本一致5. 3例抗HCV ELISA 試劑檢測陽性樣本，蛋白芯片分片段檢測檢出陽性1例，陰性1例，可疑1例；免疫印跡法RIBA檢出陽性1例，可疑2例. 說明蛋白質(zhì)芯片與RIBA試劑結(jié)果有良好的一致性，證明其具有良好的檢測準(zhǔn)確率，并可以降低ELISA法的假陽性. 對99例標(biāo)本的檢測，蛋白質(zhì)芯片的融合抗原檢測檢出陽性67例，陰性32例. 蛋白質(zhì)芯片的分片段檢測檢出陽性67例，陰性31例，可疑標(biāo)本1例. 融合抗原與分段抗原檢出病例結(jié)果基本一致，只有1例融合抗原陰性，而單片段陽性的結(jié)果，這說明了分片段檢測的必要性. 其原因可能是融合抗原是C, NS3, NS4, NS5編碼區(qū)混合抗

16、原，由于抗原不同，不同抗原組合時抗原片段濃度不同，以及載玻片吸附抗原有限，可以造成抗原配伍不合適或抗原相互干擾，從而影響抗原決定簇位點的充分暴露，造成漏檢. 蛋白質(zhì)芯片法檢出的1例可疑標(biāo)本，免疫印跡法RIBA檢出的2例可疑標(biāo)本均為單獨C區(qū)陽性，其抗NS3, NS4, NS5均陰性，而PCR結(jié)果均為陽性. 此結(jié)果提示C區(qū)可能與病毒復(fù)制有關(guān). 應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大例數(shù)進(jìn)行觀察.    通過對100份抗HCVELISA陰性的其他肝病血清，20份巨細(xì)胞病毒陽性血清，20份類風(fēng)濕因子陽性血清，218份正常人血清，用本試劑進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，證明該試劑與其他肝炎病毒抗體

17、無交叉反應(yīng)，且不受類風(fēng)濕因子、巨細(xì)胞病毒的影響，具有較好的特異性. 對載玻片進(jìn)行特殊處理后，蛋白質(zhì)抗原與片基結(jié)合穩(wěn)定，并保持原活性狀態(tài)，HCV不同片段抗體蛋白芯片的穩(wěn)定性及重復(fù)性獲得滿意結(jié)果，試劑的穩(wěn)定性可達(dá)1 a，較成熟的技術(shù)使其具有了較好的開發(fā)前景. 【參考文獻(xiàn)】 1 Yoon SK, Park YM, Byun BH, et al. The relationship between virological characteristics of hepatitis C virus (HCV) and reactivity to the regional specific protein o

18、f HCV J. Korean J Intern Med, 2000; 15(2): 109-116. 2 Bdour S. Serological diagnosis and genotyping J. Med Microbiol, 2002; 51(8): 700-704. 3羅進(jìn),李丁,張文紅,等. 蛋白芯片標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)化研究J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2005; 26(4): 311. Luo J, Li D, Zhang WH, et al. Optimization of prtein microarray marking system J. J Fouth Mil Med Univ, 2005; 26(4): 311. 4范德剛,范清宇,張惠中,等. 利用基因芯片技術(shù)篩選不同轉(zhuǎn)移能力骨肉瘤細(xì)胞