丙型肝炎病毒感染外周血單個核細胞的進一步研究

1、丙型肝炎病毒感染外周血單個核細胞的進一步研究    摘要：為進一步研究外周血單個核細胞(PBMC)感染丙型肝炎病毒(HCV)的狀況。用逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(RT-PCR)、地高辛標記 HCV探針作原位雜交和鏈酶親和素-生物素 (SABC)作 免疫組化三項技術，檢測血清和 PBMC中的 HCV RNA和HCV NS5抗原。結果顯示RT-PCR檢 測的20例慢性丙型肝炎患者，除去4例接受干擾素治療者，余16例中有14例 (87.5%) 血清 HCV RNA陽性，2例血清 HCV RNA陰性者的 PBMC-HCV RNA陽性。對 RT-PCR檢測的 9 例 P

2、BMC-HCV RNA陽性患者，進一步用原位雜交和免疫組化技術，分別檢測 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原。顯示這幾種方法的檢測結果是基本一致的，呈正相關關系?；颊叩?PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原呈散在顆粒狀或彌漫分布，主要位于胞漿中, HCV NS 5抗原還分布于胞膜上。證實HCV可以感染 PBMC，并在其中復制，復制部位在胞漿。 關鍵詞：丙型肝炎病毒；核糖核酸；抗原；外周血單個核細胞中圖法分類號：R373.2，Q522，R392.11Further Study on Infection of Peripheral Blood Mononuclear

3、Cells by Hepatitis C VirusAbstract：To further study the infection of hepatitis C virus(H CV) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), HCV RNA and HCV NS5 antigen w ere detected by RT-PCR, in situ hybridization with digoxin-labled HCV nucleotide probe and str ep atadivin-biotin enzyme complex a

4、ssay (SABC) in 20 patients with chronic hepati tis C. The results showed that among the 20 patients with chronic hepatitis C un dergoing RT-PCR, 14 cases (87.5 %) out of 16 cases were positive for serum HCV RNA and the remaining 2 cases with negative serum HCV RNA were positive for PBMC -HCV RNA exc

5、ept 4 patients treated with interferon were negative for HCV. H CV RNA and HCV NS5 antigen in PBMC were further tested by in situ hybridization an d SABC in 9 patients who were HCV RNA positive in PBMC by RT-PCR. The results o btained from the three different methods was similar and showed a positiv

6、e corre lation. HCV RNA and HCV NS5 signals in PBMC were granularly or diffusely distri buted in cytoplasm. Furthermore, HCV NS5 signal also appeared on the membrane of PBMC. The present data showed that HCV marks determined by RT-PCR were credibl e and confirmed that HCV not only could infect PBMC,

7、 but also could be replicate d in PBMC cytoplasm.Key words：hepatitis C virus;RNA, antigen;peripheral blood m ononuclear cells近年應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，成功檢測出外周血單個核細胞( PBMC )中的丙 型肝炎病毒核糖核酸( HCV RNA )。認為丙型肝炎病毒(HCV)可以感染外周血單個核細胞，并 提出這可能與 HCV的致病機理及丙型肝炎慢性化有密切關系1,2。但此項技術存 在假陽性和假陰性的可能，使得上述結論受到質(zhì)疑。鑒于此，我們采用RT-PCR、地高

8、辛 標記HCV探針作原位雜交和鏈酶親和素-生物素( SABC )免疫組化三項技術，同時檢測2 0例慢性丙型肝炎患者血清和 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原，以便進一步了解 HCV 感染PBMC的狀況，并對不同方法的檢測結果進行比較分析。1材料與方法1.1病例來源20例慢性丙型肝炎患者為本院 1996年10月至1997年10月住院或門診病人，男性13例，女 性7例，年齡在1465歲平均(42.3±18.0)歲。所有患者血清 HCV RNA均陽性，且肝 功能檢查反復異常，病程在半年以上。甲、乙、戊型肝炎病毒感染指標均陰性。其中4例患 者于近期接受過干擾素的抗病毒治療，干

9、擾素隔日300萬單位，皮下注射，療程3至6 個月不等。正常對照組15例健康人，男性 9例，女性6例，年齡在1562歲平均（40.5± 16.6)歲 。1.2方法1.2.1RT-PCR檢測血清和 PBMC中的 HCV RNA：檢測HCV RNA的RT-PCR試劑盒系浙江溫 州伊利康生物技術有限公司產(chǎn)品。1.2.2原位雜交檢測 PBMC中的HCV RNA：標本制備：取實驗對象外周靜脈抗凝血3 ml，緩慢加在等量淋巴細胞分離液上，離心 分離出 PBMC，再用 Hank's液離心洗滌 2次，然后用 RPMI-1640液將其制備成0.5×106 的細胞懸液，取 50 l滴片，

10、晾干后用多聚甲醛固定，最后置20冰箱備用。HCV探針：探針序列為：5'GCACGGTCTACGAGACCTCCCGGGGCACTCGC，32-mer ，位于HCV基因組5'端高度保守的非編碼區(qū)，5'端標記有地高辛。探針由北京賽百盛公司合 成并標記。原位雜交：凍存細胞片取出后，用蛋白酶K和甘氨酸進行雜交前的預處理，之后每 細胞片加 20 l含標記探針的雜交液(雜交液含：去離子甲酰胺，硫酸葡聚糖，2×SSC ，1×Denhart's， 400 mg/L鯡魚精 DNA， HCV探針濃度為1 mg/L)。置43雜交1618 h， 2%正常羊血清室溫封

11、閉30 min，加抗地高辛-堿性磷酸酶復合物 ( 1500稀釋 ) 37孵 育1 h，洗滌后以 NBT BCIP 37避光顯色3 h，最后逐級酒精脫水，封片。對照試驗：原位雜交實驗中設計地高辛標記對照探針（探針序列為：5'-TTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG,32-mer）組， RNA酶處 理組（雜交前先用 20mg/L RNA酶A于37 孵育30min）、探針省略組及健康人對照組。結果判斷：原位雜交檢測的 HCV RNA陽性信號為紫藍色，出現(xiàn)紫藍色信號的細胞即 為陽性細胞。計數(shù) 1000個細胞中的陽性細胞數(shù)，算出陽性細胞數(shù)的百分率。1.3免疫組化檢測 PBM

12、C中的HCV NS5抗原抗NS5單克隆抗體購自北京醫(yī)科大學肝病研究所。SABC試劑盒系武漢博士德生物工程 公司產(chǎn)品。操作按說明書進行。免疫組化實驗中設計了替代、空白和正常人對照。結果判斷 除陽性信號著色為棕黃色外，余同原位雜交。2結果2.1RT-PCR檢測的 HCV RNA結果可見20例慢性丙型肝炎患者中， 4例接受抗病毒治療患者的血清和 PBMC中 HCV RNA全部陰 性。除去這4例患者后，余16例患者中有14例（87.5%）血清 HCV RNA陽性， 9例（56.2% ）PBMC-HCV RNA陽性。2例血清 HCV RNA陰性的患者(病例8和病例13), RT-PCR和原位雜 交檢測均

13、證實其PBMC-HCV RNA陽性。2.3三種不同方法檢測的 PBMC-HCV RNA的結果比較 原位雜交檢測的HCV RNA陽性細胞中，可見紫藍色顆粒狀著色，呈散在或彌漫狀分布， 主要位于胞漿中。20例慢性丙型肝炎患者中，有8例(40.0%)PBMC-HCV RNA陽性，陽性細胞 的比例個體差異較大，從0.1%到2.0%，平均0.7%(表1）。表1不同方法檢測丙型肝炎病毒標記物的結果分析 病例序號 血清HCV RNA(RT-PCR)  外周血單個核細胞 HCV RNA(RT-PCR) HC V RNA(原位雜交) NS5(免疫組化) 1 (1.0%) (1.0%) 3 (

14、2.0%) (3.0%) 5 (0.8%) (0.6%) 8 (0.4%) (0.1%) 13 (0.1%) 14 (0.2%) 18 19 (0.6%) (0.6%) 20 (0.6%) (0.8%) 6 11 12 17 2 4 7 9 10 15 16 括號內(nèi)為陽性細胞百分率免疫組化檢測的 PBMC-HCV NS5陽性細胞呈棕黃色顆粒狀著色，呈散在或彌漫狀分 布，胞漿和胞膜上均有分布。20例患者中有 6例(30.0 %)陽性，陽性細胞的比例從 0.1% 到3.0%，平均為 1.0%（表1）。由表1可見，9例 RT-PCR檢測的 PBMC-HCV RNA陽性者中，原位雜交檢測的 PBMC-

15、 HCV RNA陽性者為8例，兩者符合率達 95%，無明顯差異(P0.05)。將原位雜交檢測 的 PBMC-HCV RNA及免疫組化檢測的 PBMC-HCV NS5抗原作比較時，可見 7例患者完全一 致。HCV NS5抗原陰性的2例患者(病例13和病例14),皆為原位雜交檢測的 PBMC-HCV RNA 陽性細胞百分率最低者。經(jīng)等級相關分析，顯示這兩種方法的檢測結果呈正相關 (r=0 .946, P0.001)。2.3原位雜交和免疫組化的特異性原位雜交和免疫組化對照實驗的結果均呈陰性，說明本實驗所采用的方法具有可靠的特異性 。3討論本實驗用臨床常用的 RT-PCR檢測血清和 PBMC的 HCV

16、 RNA。結果顯示慢性丙型肝炎患者 中，血清 HCV RNA陽性率僅達87.5%，進一步檢測PBMC-HCV RNA，可使診斷符合率達 100% 。對RT-PCR檢測的 9例 PBMC-HCV RNA陽性患者，進一步用原位雜交和免疫組化技術，分 別檢測PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原。顯示這幾種方法的檢測結果是基本一致的，呈 正相關關系。證實 RT-PCR檢測 HCV RNA的結果是基本可信的。我們曾用RT-PCR證實 HCV可以感染丙型肝炎患者的PBMC，并在PBMC中檢測出負鏈H CV RNA，病情活動者，PBMC中負鏈HCV RNA的檢出率越高。提示 HCV不僅可以感染

17、 PBMC， 而且可在其中復制3。本文原位雜交和免疫組化檢測 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原的結果顯示，二者均出現(xiàn)在胞漿中， HCV NS5抗原還表達于胞膜上，而且二者 的檢測結果呈正相關。進一步證實HCV可以感染 PBMC，并可在其中復制，復制的部位在胞漿 中。本文部分患者血清 HCV RNA陰性而 PBMC-HCV RNA陽性的結果再次提示，血清 HCV RNA 陰性，并不能完全排除 HCV感染，也不一定表明感染的清除。檢測 PBMC-HCV RNA對于臨床 判斷病情和抗病毒療效的考核具有重要意義。與Sansonno4所獲結果相似，本文原位雜交和免疫組化檢測的 PBMC

18、-HCV RN A及PBMC-HCV NS5抗原陽性細胞百分率也較低。這有幾種可能：PBMC的HCV感染率很低 ；HCV感染的淋巴細胞亞群的差異；檢測方法或試劑的敏感性差異。迄今 HCV感染慢性化的致病機理仍不清楚。 HCV感染 PBMC后不易清除，隱藏在 PBMC中 的HCV可能是 HCV感染復發(fā)和慢性化的原因之一。此外，我們還發(fā)現(xiàn) HCV感染 PBMC后，可引 起CD4+/CD8+比例失調(diào)(另文發(fā)表)。這種 HCV感染 PBMC引起 T淋巴細胞亞群的變化，可 能導致免疫功能失調(diào)，從而不能有效地清除病毒5，可能是另一重要原因。參考文獻1，Taliani G, Badolato L, Lecce R et al. Hepatitis C virus RN A in peripheral blood mononuclear cells: relation with response to interferon treatment. J Med Virol, 1995, 47:162，Kao T H, Chen P J, Lai M Y et al. Positive and negative str and at hepatitis C virus RNA sequences in peripheral blood mononuclear cells in patients w