凝聚胺介質(zhì)交叉配血試驗(yàn)操作規(guī)程

1、凝聚胺介質(zhì)交叉配血試驗(yàn)操作規(guī)程(SOP文件)1目的作為介質(zhì)輔助用于完全抗體及不完全抗體的臨床篩選檢測(cè)及輔助用于臨床交叉配血實(shí)驗(yàn)。2檢驗(yàn)原理紅細(xì)胞表面帶有大量的負(fù)電荷，以避免其產(chǎn)生自發(fā)性聚集，當(dāng)紅細(xì)胞懸浮在電解質(zhì)時(shí)， 陽(yáng)離子會(huì)被紅細(xì)胞的負(fù)電荷所吸引， 此時(shí)紅細(xì)胞則被擴(kuò)散的雙層離子云所圍繞，而形成Zeta電位，Zeta電位決定紅細(xì)胞之間的排斥作用。凝聚胺技術(shù)首先利用低離子溶液(LIM),降低介質(zhì)的離子強(qiáng)度，減少紅細(xì)胞周圍的陽(yáng)離子云，以促進(jìn)紅細(xì)胞和血清(血漿)中的抗體結(jié)合。其后， 加入凝聚胺(Polybrene)溶液， 它是一種高價(jià)陽(yáng)離子多聚物、 肝素中和劑，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可以中和紅細(xì)胞表

2、面帶有的負(fù)電荷，使紅細(xì)胞Zeta電位降低，縮短紅細(xì)胞之間的距離，使紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性的凝聚。最后，加入懸浮液(Resuspending),Resuspending具有中和凝聚胺(Polybrene)陽(yáng)離子的作用， 使正常的紅細(xì)胞非特異性凝聚散開(kāi)， 試驗(yàn)結(jié)果為陰性； 但如果紅細(xì)胞被相應(yīng)的抗體致敏，則會(huì)被凝聚胺凝結(jié)，凝集就不會(huì)散開(kāi)，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。3儲(chǔ)存條件及有效期未開(kāi)封試劑應(yīng)貯存于2c25C、相對(duì)濕度不大于80%無(wú)腐蝕性氣體的室內(nèi)；已開(kāi)封試劑應(yīng)貯存于相對(duì)濕度不大于80%,無(wú)腐蝕性氣體和通風(fēng)良好的室溫環(huán)境，試劑用后應(yīng)及時(shí)擰緊瓶蓋保存；未開(kāi)封試劑的有效期為二年，在有效期內(nèi)的已開(kāi)封試劑應(yīng)在開(kāi)封后的6個(gè)

3、月內(nèi)使用完。04樣本要求4.1新鮮血清，含EDTAt凝血漿、3%5%勺紅細(xì)胞懸液。4.2不能使用溶血標(biāo)本及含枸檬酸鈉、肝素抗凝血漿標(biāo)本。5檢驗(yàn)方法輔助交叉配血試驗(yàn)1取試管二支，標(biāo)主次側(cè)，主側(cè)管加病人血清（血漿）2滴，加供血者3%5%：細(xì)胞懸液（洗滌或不洗滌均可）1滴，次側(cè)管反之。1各加LIM0.65ml,混合均勻后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均勻。1用離心機(jī)3400轉(zhuǎn)/min（相當(dāng)于1000g離心力）離心10秒，然后把上清液倒掉，不要瀝干，讓管底殘留約0.1ml液體。1輕輕搖動(dòng)試管，目測(cè)紅細(xì)胞有無(wú)凝集，如無(wú)凝集，則必須要重做。1最后加入Resuspending2滴， 輕輕搖動(dòng)試管

4、混合并同時(shí)觀察結(jié)果。 如果在60秒內(nèi)凝集散開(kāi)，代表是由Polybrene引起的非特異性聚集，配血結(jié)果相合；如凝集不散開(kāi)，則為紅細(xì)胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，配血結(jié)果不相合。如反應(yīng)可疑，可進(jìn)一步倒在玻片上用顯微鏡觀察。6注意事項(xiàng)1.1可以用含EDTAi血漿代替血清使用。1.2若病人血清（血漿）含肝素，如洗腎患者，須多加46滴Polybrene溶液以中和肝素。1.3本試劑盒的操作方法也適用于抗體鑒定。1.4若試劑使用前為低溫貯存，請(qǐng)回復(fù)室溫再行操作。1.5加做輔助性抗人球蛋白試驗(yàn)，目的是增加檢測(cè)抗-K的敏感性。寧城縣蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院輸血科NCXMYZYYYSXK1.6在冬天室溫極低的情況下，操作交叉配

5、血試驗(yàn)，某些病人血清中可能含有冷凝集素等因素，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果由現(xiàn)。若有此懷疑，建議在最后滴入Resuspending時(shí)，將試管立即置入37c水浴中，輕輕搖動(dòng)試管混合，并在60秒內(nèi)觀察結(jié)果。1.7紅細(xì)胞抗原檢測(cè)步驟同抗體篩檢試驗(yàn)，具檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)血清用已知標(biāo)準(zhǔn)血清。1.8用戶可使用IgG抗D抗體 （效價(jià)64）與RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞反應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)試本試劑的有效性。ABO血型定型操作規(guī)程（SOPt件）1目的用于鑒定人ABC血型2檢驗(yàn)原理本品系用產(chǎn)生抗A或抗B血型抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液（或在上清液中加入少量同型腹水）配制而成，采用凝集試驗(yàn)原理，專供鑒定人ABO血型用。3樣本要求本試劑適用于全血或

6、10%、5%紅細(xì)胞懸液。4檢驗(yàn)方法平板法（玻片法）：本品與受檢者全血或10%紅細(xì)胞生理氯化鈉懸液按1:1攪勻，不必再稀釋，按照有無(wú)凝集判定結(jié)果5結(jié)果判斷血型抗A試劑抗B試劑A+B-+O-AB+注：“+”有凝集反應(yīng)，“-”無(wú)凝集反應(yīng)6檢驗(yàn)結(jié)果的解釋將已知的抗A、抗B血型定型試劑與受檢者的紅細(xì)胞混合時(shí)，與抗A血型定型試劑發(fā)生凝集者即為A型血型， 與抗B血型定型試劑發(fā)生凝集者即為B型血型，與抗A、抗B血型定型試劑均發(fā)生凝集者即為AB型血型，與抗A、抗B血型定型試劑均不發(fā)生凝集者即為O型血型。7注意事項(xiàng)9.1對(duì)含有較多自身冷凝集的受檢者，在鑒定血型時(shí)往往被誤認(rèn)為AB血型，遇到此種情況，需用37生理氯化

7、鈉溶液洗滌受檢者細(xì)胞2-3次，以去除吸附在紅細(xì)胞上的凝集素，然后再鑒定血型。9.2在做配型試驗(yàn)時(shí)，如發(fā)現(xiàn)有不配合現(xiàn)象，則取受檢者血清，用已知A血型或B血型細(xì)胞進(jìn)行反定型試驗(yàn)，以核實(shí)原鑒定的血型是否正確。9.3用立即試管法不能測(cè)由亞型（如Ax）,需延長(zhǎng)作用時(shí)間。9.4本品如由現(xiàn)渾濁或變色則不能使用， 若開(kāi)瓶使用時(shí)間較長(zhǎng)后， 最好用已知ABO血型紅細(xì)胞檢查結(jié)果是否與已知血型相符，以防制品污染，變質(zhì)失效，而造成鑒定錯(cuò)誤。9.5在有效期內(nèi)使用。ABO血型反定型操作規(guī)程（SOP文件）1目的用于ABO血型的反定型檢測(cè)，該產(chǎn)品不用于血源篩查。寧城縣蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院輸血科NCXMYZYYYSXK2檢驗(yàn)原理本品系采

8、用三人份同型混合的A1型、B型和O型合格人紅細(xì)胞經(jīng)洗滌后懸浮于紅細(xì)胞保存液中配制而成。采用凝集試驗(yàn)原理，用已知的A1,B,O型紅細(xì)胞測(cè)定被檢者血清/血漿中有無(wú)相應(yīng)的抗A或抗B抗體（反定型試驗(yàn)），結(jié)合正定型結(jié)果判定ABOM型。3檢驗(yàn)方法試管法取被檢者血清/血漿各50ul分別加入3支標(biāo)記好的試管中；分別各加50ulA1、B、O試劑紅細(xì)胞；搖動(dòng)試管，混勻。于900g離心15s,或室溫靜止1h;首先檢查是否溶血，（溶血可能是陽(yáng)性結(jié)果，或是細(xì)菌污染。）輕輕搖動(dòng)懸浮紅細(xì)胞。觀察凝集情況，并立即記錄結(jié)果。必要時(shí)可借助顯微鏡觀測(cè)。4檢驗(yàn)結(jié)果的解釋ABO血型正反定型反應(yīng)格局表正定型反定型血型抗A試劑抗B試劑A1

9、細(xì)胞B細(xì)胞O細(xì)胞+-+-A-+-B-+-O+-AB注：“+”有凝集反應(yīng)，“-”無(wú)凝集反應(yīng)5注意事項(xiàng)如果在反定型試驗(yàn)中，受檢者的血清/血漿與O血型紅細(xì)胞試劑產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，則需要添加自身對(duì)照試驗(yàn)。如果自身對(duì)照為陽(yáng)性，表明是冷凝集素導(dǎo)致。如果自身對(duì)照為陰性，則表明被檢者血清或血漿中可能存在ABO系統(tǒng)以外的其他血型系統(tǒng)的抗體干擾定型。請(qǐng)按照相關(guān)的試驗(yàn)方法解決上述定型問(wèn)題。本品如由現(xiàn)紅細(xì)胞顏色變成暗紫色或紅細(xì)胞自發(fā)凝集，由現(xiàn)菌落或溶血，則不能使用。若開(kāi)瓶使用時(shí)間較長(zhǎng)后，最好用注冊(cè)上市的抗A、抗B血型定型試劑檢查結(jié)果是否與已知血型相符，以防制品污染、變質(zhì)失效、而造成檢定錯(cuò)誤。為了便于鑒別，A1血型紅細(xì)胞試

10、劑標(biāo)簽為藍(lán)色，B血型紅細(xì)胞試劑標(biāo)簽為黃色，O血型紅細(xì)胞試劑標(biāo)簽為紅色。乙型肝炎病毒表面抗原操作規(guī)程（SO發(fā)件）.目的用于血液的篩查和臨床乙型肝炎病毒感染的輔助診斷。.檢驗(yàn)原理本品系用乙型肝炎表面抗體（抗-HBs）包被的微孔板和酶標(biāo)記抗-HBs及其他試劑制成，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法原理檢測(cè)人血清和血漿中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）.適用儀器微量移液器；37c恒溫水浴箱；振蕩器；洗板機(jī)或洗瓶；計(jì)時(shí)器；酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)450nmn,參考波長(zhǎng)630nmi.樣本要求樣本采集不需要特殊準(zhǔn)備，按照正常的采血技術(shù)收集血液，全血樣本寧城縣蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院輸血科NCXMYZYYYSXK最好先放置37c處理2

11、小時(shí)，再將血樣本充分離心，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心6分鐘以上，使血清（血漿）不含有或極少含有血細(xì)胞。如果為抗凝血樣本，應(yīng)將血樣本充分離心后，最好再放置室溫2小時(shí)以上。樣本中含有疊氮鈉會(huì)影響試驗(yàn)的結(jié)果，高度溶血的樣本、沒(méi)完全收縮的血清樣本或有微生物污染的樣本可能會(huì)引起錯(cuò)誤的結(jié)果。新鮮的樣本在28c無(wú)菌條件下可保存一周，新鮮樣本可長(zhǎng)期貯存在-20C或以下，避免反復(fù)凍融。.檢驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：從冷藏環(huán)境中取由試劑盒，在室溫下平衡30分鐘，同時(shí)將洗滌液進(jìn)行1:40倍稀釋。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照3孔，空白對(duì)照1孔。加樣：在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照孔內(nèi)分別加入陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照50ul,其余每孔加待測(cè)血清或血漿50

12、ulo蓋上封孔膠片，置37c水浴孵育60分鐘。洗滌：棄去孔內(nèi)液體，用稀釋后的洗滌液連續(xù)洗滌5次后，拍干孔內(nèi)液體。加酶結(jié)合物：空白孔除外，每孔各加酶結(jié)合物50ul。蓋上封孔膠片，置37c水浴孵育30分鐘。洗滌：棄去孔內(nèi)液體，用稀釋后的洗滌液連續(xù)洗滌5次后，拍干孔內(nèi)液體。加底物液： 每孔先加底物液A50ul,再加底物液B50ul,混勻， 蓋上封孔膠片， 置37c條件下避光顯色30分鐘后，加終止液50ul,混勻，終止反應(yīng)。.參考值（參考范圍）終止后盡快測(cè)定，波長(zhǎng)450nni先用空白孔校零，測(cè)OD值。如果選用雙波長(zhǎng)測(cè)定，不必設(shè)置空白對(duì)照空。按下列公式計(jì)算：COV=陰性對(duì)照平均OD值X2.1倍陰性對(duì)照平

13、均OD直低于或等于0.05,按0.05計(jì)算；高于0.05時(shí),按照實(shí)際OD直計(jì)算。.檢驗(yàn)結(jié)果的解釋樣品OD直S/COV1時(shí)，待測(cè)樣本HBsAg為陽(yáng)性；樣品OD直S/COV1時(shí)為陽(yáng)性樣品OD值S/COV1時(shí)，待測(cè)樣本為陽(yáng)性；樣品OD值S/COV1時(shí)，待測(cè)樣本為陰性。.注意事項(xiàng)本品僅用于體外診斷，僅限檢測(cè)人體血清或血漿；檢測(cè)結(jié)果作為診斷指標(biāo)之一。使用時(shí)，從冷藏環(huán)境取由試劑盒，置室溫平衡30分鐘后，方可進(jìn)行測(cè)試。剩余試劑應(yīng)及時(shí)封存于冰箱內(nèi)保存，備用。結(jié)果判定需在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)完成。封孔膠片不得重復(fù)使用。在有效期內(nèi)，微孔板密封袋如有漏氣現(xiàn)象，不影響試驗(yàn)結(jié)果。試劑盒在有效期內(nèi)使用，不同批號(hào)不得混用。

14、確保樣本加樣量的準(zhǔn)確，如果加樣不準(zhǔn)確可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的試驗(yàn)結(jié)果。使用微量移液器加樣時(shí)，每次應(yīng)更換吸頭吸取樣本。8.9在操作過(guò)程中應(yīng)盡量避免反應(yīng)微孔中產(chǎn)生氣泡。準(zhǔn)確控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。洗板：1用洗板機(jī)洗板時(shí)，洗板機(jī)的加液量應(yīng)注意控制，既避免洗液過(guò)量而溢生，又能充滿反應(yīng)微孔，并經(jīng)常檢查加液頭是否堵塞；2洗板機(jī)最好每次使用前、后沖洗干凈，防止管路堵塞或腐蝕；3洗板時(shí)所用的吸水紙請(qǐng)勿反復(fù)使用。本試劑盒及臨床樣本均應(yīng)視為傳染性物質(zhì)或潛在傳染性物質(zhì)，請(qǐng)按相關(guān)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范執(zhí)行和處理。.參考文獻(xiàn)中國(guó)藥典2010年版三部體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則（國(guó)食藥監(jiān)械【20071240號(hào)）HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室操作

15、規(guī)程（SOPC件）.檢驗(yàn)?zāi)康臋z驗(yàn)人體血清中是否感染HIV病毒.檢驗(yàn)原理本產(chǎn)品系用純化基因工程人類免疫缺陷病毒“1”型和“2（HIV-1和HIV-2）抗原包被的微孔板和酶聯(lián)記的HIV-1和HIV-2抗原及其它試劑組成試劑盒，應(yīng)用雙原夾心法原理檢測(cè)人血清或血漿中的人類免疫缺陷病毒抗體，用于獻(xiàn)血員及高危人群中人類免疫缺陷病毒的篩查。.檢驗(yàn)條件操作人員對(duì)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)心中有數(shù)，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程。洗板機(jī)，酶標(biāo)儀，加樣器必須定期校正。試劑按規(guī)定保存。.標(biāo)本采集門(mén)診病人由檢驗(yàn)科人員無(wú)菌抽取靜脈血2ml分離血清備用。住院病人由護(hù)士采血送檢驗(yàn)科。要避免溶血。.設(shè)備和試劑設(shè)備全自動(dòng)ZDM;酶標(biāo)洗板機(jī)，MR-96A酶標(biāo)儀

16、。試劑珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)的抗HIV診斷試劑盒。.操作方法實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備從冷環(huán)境中取由試劑盒，室溫平衡半小時(shí)，同時(shí)將濃縮洗液用蒸儲(chǔ)水作1:20稀釋備用。編號(hào)每板應(yīng)設(shè)空白對(duì)照1孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔，質(zhì)控1孔。加樣每孔加入50ul樣品稀釋液，并分別在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品或陰、陽(yáng)對(duì)照、質(zhì)控品50ulo空白孔內(nèi)只加稀釋液。溫育用封板膜封板后置37c溫育60分鐘。加酶除空白對(duì)照孔外，每孔加50ul酶標(biāo)記物，輕輕震動(dòng)混勻，用封板膜將板孔封好，置37c溫育30分鐘。洗板小心將封板膜揭掉，選擇6次的程序洗板，最后排干。顯色每孔先加顯色劑A再加顯色劑B各50ul,輕輕混勻后置37C避光顯色30分鐘。

17、測(cè)定每孔加終止液50ul,輕輕混勻，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm及620nm測(cè)定各孔OD值。.參考值試劑空白標(biāo)準(zhǔn)：試劑空白A值應(yīng) V0.08（空白校零前）陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照A值應(yīng) W0.12陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)：抗-HIV-1陽(yáng)性對(duì)照A值應(yīng) A0.8抗-HIV-2陽(yáng)性對(duì)照A值應(yīng) A0.8臨界值（C.O.）計(jì)算：寧城縣蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院輸血科NCXMYZYYYSXK臨界值（C.O.）=陰性對(duì)照平均A值+0.15備注：陰性對(duì)照平均A值小于0.08按0.08計(jì)算，大于0.08按試劑值計(jì)算.檢驗(yàn)結(jié)果的解釋樣品A值 A 臨界值（C.O.）為HIV抗體陽(yáng)性樣品A值臨界值（C.O.）為HIV抗體陰性備注：初次檢驗(yàn)陽(yáng)性者應(yīng)重

18、新取樣進(jìn)行雙孔復(fù)試，如果復(fù)試中任何一孔為陽(yáng)性則樣品視為HIV抗體陽(yáng)性，對(duì)復(fù)試結(jié)果為陽(yáng)性的樣品請(qǐng)按全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范處理?？赡軐?duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素：.不充分的洗滌，如侵泡時(shí)間不夠或洗液量不足。.洗板機(jī)針孔堵塞或位置調(diào)節(jié)不當(dāng)，孔底洗液殘留量過(guò)多。.加樣量不準(zhǔn)。.在檢驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免交叉污染及酶結(jié)合物和其他試劑的污染。.沒(méi)有使用正確的波長(zhǎng)讀數(shù)。.測(cè)試過(guò)程中應(yīng)避免反應(yīng)孔的干燥。.血清或血漿樣品如有溶血、微生物污染、血脂過(guò)多以及黃疸等情況，可能會(huì)對(duì)檢驗(yàn)產(chǎn)生影響。.質(zhì)量控制每次做室內(nèi)質(zhì)控，同標(biāo)本一起做，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)處理。每年兩次參加省臨床檢驗(yàn)中心免疫質(zhì)評(píng)，以保證檢驗(yàn)質(zhì)量.注意事項(xiàng)本試劑的使用單位必須是經(jīng)當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門(mén)批準(zhǔn)的寧城縣蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院輸血科NCXMYZYYYSXKHIV初篩實(shí)驗(yàn)室。檢測(cè)必須符合HIV試驗(yàn)室管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染。操作時(shí)必須戴