血紅蛋白電泳的意義和判斷高級版(1)

1、整理ppt1整理ppt2目的血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的回顧Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血紅蛋白檢測說明血紅蛋白臨床結(jié)果說明整理ppt3血紅蛋白的結(jié)構(gòu)血紅蛋白分子是由4條多肽鏈(2對)和4個(gè)可以結(jié)合鐵和氧氣的血紅素. Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.整理ppt4三維結(jié)構(gòu)4 亞單位2 alpha鏈2 alpha genes3 非 alpha鏈 : beta, delta, gamma1 b gene , 1 d gene , 2 g genes整理ppt5正常結(jié)果H

2、b A: a2b2Hb F: a2g2Hb A2:a2d2 +-瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 Hydrasys (Sebia)堿性緩沖液堿性緩沖液成人成人新生兒新生兒整理ppt6血紅蛋白遺傳病類型(HEMOGLOBINOPATHIES) ?血紅蛋白疾病血紅蛋白疾病血紅蛋白性質(zhì)變化 : 血紅蛋白分子病結(jié)構(gòu)異常, 一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸變異或缺失, 都將會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白分子的電性發(fā)生改變 常見血紅蛋白變異體b-globin : S C DPunjab E血紅蛋白含量變化 : 地中海貧血地中海貧血合成或合成調(diào)控異常 :b globin b Thalassemiasa globin a Thalassemias合并型

3、 : 血紅蛋白分子病Hemoglobinopathies /地貧 Thalassemias整理ppt7血紅蛋白遺傳病遺傳性疾病基因?qū)W圖譜正?；虍惓；蛘韕pt8異常血紅蛋白類型目前, 已經(jīng)證實(shí)的有超過1000 種以上的變異體(a, b, g and d)大部分變異體出現(xiàn)頻率較低, 并且沒有明顯臨床癥狀4種主要變異體 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出現(xiàn)頻率較高 ( 特定人群)攜帶者會(huì)出現(xiàn)健康問題兒童可能在出生時(shí)即伴隨有嚴(yán)重癥狀整理ppt9Thalassemias整理ppt10常見與地中海區(qū)域: 意大利, 西班牙,希臘, 近東地區(qū), 非洲北部.同樣常見于東南

4、亞 : 泰國,印度, 越南,中國, 印尼.o 臨床癥狀* Beta 地貧重癥型 - 嚴(yán)重貧血 (需要長期輸血治療)* Beta 地貧中間型* Beta 地貧輕微型 - 無臨床癥狀Beta 地中海貧血o 常見區(qū)域bo 沒有Beta鏈合成b+ 合成能力下降整理ppt11Alpha 地中海貧血o 臨床癥狀: 根據(jù)Alpha基因的表達(dá)狀態(tài), 有4個(gè)不同程度的Alpha地貧癥狀* 1 個(gè)基因表達(dá)沉默: 靜止型 (非常難檢測到, 在出生會(huì)測到Hb Barts 1-2% )* 2 個(gè)基因表達(dá)沉默: 輕型alpha地貧,在出生會(huì)測到Barts 2-10%* 3 個(gè)基因表達(dá)沉默: 血紅蛋白Hb H病, 出生時(shí)出

5、現(xiàn)2-30% Barts, 兒童-成人出現(xiàn) 10-15% Hb H* 4 個(gè)基因表達(dá)沉默: Hb Barts胎兒水腫綜合征 (死胎) o常見區(qū)域 常見與遠(yuǎn)東地區(qū),非洲和地中海區(qū)國家整理ppt12其他特征其他特征Hb HHb A2Hb F貧血貧血小紅細(xì)胞小紅細(xì)胞靶細(xì)胞靶細(xì)胞異常異常出生時(shí)少量出生時(shí)少量的的 (2%) Hb Barts0正常正常000一條鏈缺失出身時(shí)出身時(shí)Hb Barts (5%)0正常或減少正常0002條鏈缺失不穩(wěn)定血紅不穩(wěn)定血紅蛋白溶血性蛋白溶血性貧血貧血 (Hb H)10-15%減少也許增加輕微的到嚴(yán)重的+3條鏈缺失胎兒水腫綜胎兒水腫綜合癥合癥 (hydrops fetali

6、s)00100 % Hb Barts嚴(yán)重的-4條鏈缺失整理ppt13基因型基因型診斷診斷血常規(guī)血常規(guī)臨床癥狀臨床癥狀檢測結(jié)果檢測結(jié)果aa/aaaa/aa無Hb A : NHbA2 : N (2-3.5%)-a/aa-a/aaa-Thalassaemia 2 雜合體(靜止型)輕微小紅細(xì)胞癥MCV : 75-80fLMCH: 20-24無Hb A and HbA2: NHb Barts 0-3% at birthConfirmation by molecular biology-a/-a-a/-aa-Thalassaemia 2 純合體小紅細(xì)胞癥血紅蛋白減少Hb: 11-12 g/dL無明顯臨床癥

7、狀Hb A and HbA2: NHb Barts 2-8% at birth- -/aa- -/aaa-Thalassaemia 1 雜合體MCV: 65-75 MCH: 20-24需要分析序列分析或DNA序列分析 - -/-a- -/-aHbH小紅細(xì)胞癥血紅蛋白減少Hb: 8-11 g/dLMCV : 55-65 MCH: 20-24出現(xiàn)溶血脾臟腫大HbA2 N or Hb Barts 5%Hb H 10-20%- -/- - -/- -a-Thalassaemia 1 純合體(死胎)嚴(yán)重貧血 水腫胎Hb: 8-11 g/dLMCV 100-110 MCH 無法存活死胎Absence of

8、 HbA and HbFHb Barts 80-100%Hb Portland 5%整理ppt14鐮刀型紅細(xì)胞血癥變異體出現(xiàn)在 6 GAG (谷氨酸) GTG (纈氨酸)NSSASNHbSN NHbS ASNHbAHbSN NSSHbAHbSChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Htrozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg gChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Heter

9、ozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg g整理ppt15C型血紅蛋白分子病 變異體位置:AA 6: GAG (谷氨酸) AAG (Lys)HbA Heterozygote ACHbAHbCHbASC Compound heterozygotyHbAHbCHbSHtrozygote compositeACSCChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Htrozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db b

10、Ag gAg gGg gGg gChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1SC heterozygote compoundChromosomes 11Heterozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg g整理ppt16D型血紅蛋白分子病常見區(qū)域:常見于印度.特點(diǎn): 變異體位置 b121 Glu (谷氨酸,負(fù)電荷) Gln (谷氨酰胺, 不帶電荷) (D- Los Angeles = D-Punjab)(6 different Hb D according to the position of t

11、he mutation)堿性緩沖液中: 電荷下降 M電泳速度變度變慢電泳速度變度變慢,靠近靠近Hb S臨床癥狀:基因雜合體:Hb A fraction: 65 70 %Hb D fraction: 30 35 %基因純合體:輕微貧血Hb A fraction: absenceHb D fraction: 100 %整理ppt17E型血紅蛋白分子病常見區(qū)域:常見與東南亞地區(qū).特點(diǎn): 變異位點(diǎn) b26 Glu (谷氨酸,負(fù)電荷) Lys (賴氨酸,正電荷)堿性緩沖液: 總體帶電荷下降 凝膠電泳中凝膠電泳中,出現(xiàn)在出現(xiàn)在HbC附近附近臨床癥狀:雜合體:Hb A fraction: 65 70 %Hb

12、 E fraction: 30 35 %基因純合體:輕微貧血Hb A fraction: absenceHb E fraction: 100 %整理ppt18下列情況下,需要進(jìn)行血紅蛋白檢測 臨床和遺傳問題 (產(chǎn)前診斷) 貧血,小紅細(xì)胞癥 新生兒篩查 對來自地貧高發(fā)區(qū)人口,進(jìn)行篩查 對診斷有幫助的其他信息 患者臨床癥狀,年齡,籍貫和其他相關(guān)的背景 (輸血記錄) 血液全套檢測, 網(wǎng)狀細(xì)胞級別和進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)鏡檢 Hb電泳 (EDTA抗凝管) 離子平衡和溶血情況 整理ppt19血紅蛋白檢測的幾種方法目前, 血紅蛋白檢測步驟如下:- 電泳法對Hb進(jìn)行檢測或者使用等電聚焦電泳法- 使用 HPLC法進(jìn)行確

13、認(rèn).整理ppt20凝膠電泳結(jié)果識別表 整理ppt21在pH梯度的凝膠片上, 根據(jù)蛋白不同的等電點(diǎn),對蛋白進(jìn)行分離 Hb電泳位置取決于緩沖液PH值蛋白電泳至其等電點(diǎn)位置后,停止泳動(dòng)At pI=pH, Hb does not have a net charge and stops migrating電泳分離效果好, 但時(shí)間長.需要經(jīng)驗(yàn)豐富才能獲得良好結(jié)果及進(jìn)行結(jié)果判斷等電聚焦電泳法整理ppt22介于普通電泳和等電聚焦電泳之間的新方法:- 通過毛細(xì)管電泳法, 即可以獲得與IEF方法一樣的分辨率,同時(shí)檢測結(jié)果量值Hb A2/Hb F同樣精確.- 出現(xiàn)異常變異體后:使用下列方法確認(rèn):* ITANO te

14、st (solubility test)* HPLC液相色譜* Genotyping基因篩查整理ppt23整理ppt24毛細(xì)管電泳法原理毛細(xì)管電泳法原理 Peltier溫控橋Anode +Cathode -檢測器氘光燈整理ppt25整理ppt26Capillarys/Minicap血紅蛋白電泳血紅蛋白條帶,在電滲力的作用下,8分鐘即完成電泳過程, 然后,在415nm紫外光下被檢測并顯示出來.正常質(zhì)控品正常質(zhì)控品 必須在每天檢測前使用Capillarys :- 檢測速度: 40 樣品/小時(shí)-試管架1 至 7號位放置樣品, 8號位放 4ml溶血素Minicap :- 檢測速度: 10 樣品/小時(shí)-

15、試管架1 至 26號位放置樣品, 27號位放溶血素(8個(gè)樣品消耗5ml溶血素)整理ppt27Capillarys/Minicap血紅蛋白檢測標(biāo)本要求抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需要對輸血患者采血, 需要在輸血前采集血液.使用去除血漿后的紅細(xì)胞(隔夜或5000 rpm,5分鐘離心后樣品) + 4C以上, 標(biāo)本最多存放7天.需要長期存放, 可以洗滌紅細(xì)胞后,放置于 -80C (可存放至少 3個(gè)月) Capillarys Minicap 血紅蛋白條帶識別表整理ppt29整理ppt30正常Hb A2 質(zhì)控品條帶結(jié)果可錄為條帶結(jié)果可錄為QC整理ppt31Hb AF

16、SC質(zhì)控品, 可用來作為參照曲線,便于異常結(jié)果的判斷整理ppt32Hbs A, F,A2 檢測結(jié)果可通過顏色進(jìn)行區(qū)分 異常區(qū)帶顯示為灰色整理ppt33主要異常血紅蛋白變異體Z15 Hb HZ12 Hb BartZ10 Hb HopeZ9 Hb A Z7 Hb FZ6 Hb D PunjabZ5 Hb SZ4 Hb EZ3 Hb A2Z2 Hb CHbEHbSHbH整理ppt34 HbS 變異體, Hb A2 正常值 6 Glu ValHb A = a2b2Hb S = a2bS2Hb A2 = a2d2整理ppt35Capillarys/Minicap血紅蛋白試劑優(yōu)勢:無需前處理(不需要洗血和

17、溶血)，直接檢測血紅蛋白C和E能從A2分離開根據(jù)S型和D型的細(xì)微電荷區(qū)別, 進(jìn)行區(qū)分. 對于處于A和S之間的F給予個(gè)性化和聚焦的精確量化.對A2型血紅蛋白有很好的分辨率和分離效果Hb Barts 和 Hb H可以很好的檢測和量化糖化型血紅蛋白電泳出現(xiàn)在主體峰內(nèi),不影響檢測結(jié)果整理ppt36異常結(jié)果分析整理ppt37Case 2:31 Y Female, 血紅蛋白 12.8, 紅細(xì)胞壓積 37.4 (I)A = 84.1 %F = 1.5%A2= 5.5%整理ppt3831 Y Female, Hgb 12.8, Hematocrit 37.4 (II)AlkAcidFSCA2CSF-thala

18、ssemia- 輕型輕型A2AAAACPCPA=93.4%, F=1.1%, A2=5.5%整理ppt39Hb A 92.5%Hb F 2.6Hb A2 4.9%Hb FHb AHb A267 Y female from Tunisia, Hgb 9.1, hematocrit 28, MCV 62小紅細(xì)胞癥小紅細(xì)胞癥; beta thalassemia輕型輕型整理ppt40Hb H 4%Hb A 94.7%Hb A2 1.3%Hb AHb A2Hb HChild 9 Y, from Laos, Hgb 8, hematocrit 27.9, MCV 54.1嚴(yán)重小紅細(xì)胞癥嚴(yán)重小紅細(xì)胞癥; 血

19、紅蛋白血紅蛋白H病，需要基因篩查病，需要基因篩查整理ppt41Hb H and Barts - Alpha-thalassemia H Barts 整理ppt42Case 1: 13 Y Male, Hgb 8.1, Hct 24.0 (I)A2= 6.1%S = 82.8 %整理ppt43Case 1:13 Y Male, Hgb 8.1, Hematocrit 24.0 (II)AlkAcidFSCSA2 + FCSFS Hgb F/S, A2=4.6% + beta thalassemia minorA2AFACPCP整理ppt44Case 2:65 Y Male, Hgb 9.4, H

20、ematocrit 27.3 (I)Co-migration with A2A= 62.1 %A2 = 31.7%*整理ppt45Case 2: Hb E Migrates Separately From Hb A226 GluLys整理ppt4621Y, pregnant woman,Hgb 13.1, hematocrit 38.6Hb A 95%Hb F 2.1%Hb A2 2.9%Normal pattern, Hb F slightly increased (pregnancy)整理ppt47Baby 2 months old,father from Martinique, moth

21、er from Central Africa, Hgb 11, hematocrit 29.8Hb F 49.5%Hb S 25.9%Hb A2 1.8%Hb C 22.8%Hb FHb SHb A2Hb CSC compound heterozygoty整理ppt48Diabetic patient, 54 Y, Hgb 14.5, hematocrit 43.5, MCV 88 HbA1c measurement (HPLC Tosoh)Hb A 54.7%Hb X 41.7%Hb A2 3.6%Hb AHb A2Hb XNormal hemogram; compatible with h

22、eterozygote A/D;To be identified by genotyping整理ppt49Hb A 51.8%Hb A2 2.9%Hb C 35.9%Hb AHb A2Hb CDiabetic patient, 61 Y, Hgb 11.6, hematocrit 34.8, MCV 85Slight anemia; compatible with heterozygote A/CTo be identified by genotyping 整理ppt50Adopted child, 4 Y, originated from Haiti, Hgb 10.9, Hematocri

23、t 31.3, MCV 76.9Hb A 97.5%Hb A2 1.4%Hb X 1.1%Hb AHb A2Hb XSlight anemia; heterozygous Delta mutation, asymptomatic整理ppt51Diabetic patient, 73 Y, Hgb 10.2, hematocrit 30.8, MCV 87.3Alpha chain mutation; genotyping confirmation:Hb Winnipeg a a 75 Asp TyrHb A- WiHb A2-WiHb AHb A2整理ppt52Hb A 90.3%Hb F 3

24、.8%Hb A2 5.9%Hb AHb FHb A2Hb A 64%Hb S 33.1%Hb A2 2.9%Hb AHb SHb A2Hb A 2.2%Hb F 67.3%Hb S 29.1%Hb A2 1.4%Hb AHb FHb SHb A2Father: Beta thalassemia minor Mother: Heterozygote ASBaby 2 months old: Association S - beta thalassemia整理ppt53Hb Lepore on Minicap/CapillarysHb A2Hb AHb FHb LeporeAFSC control

25、 overlaying整理ppt54Hb Leporeb和d鏈重新組合形成.在堿性緩沖液下電泳: 總體帶電荷下降 電泳位置出現(xiàn) 在S型血紅蛋白附近基因雜合體:Hb Lepore fraction: 5 15 %Clinical signs of minor b thalassemia基因純合體:Hb Lepore fraction: about 30 %Clinical signs of homozygous b thalassemia常見區(qū)域:Lepore (- Boston Washington): 常見于意大利人群; 同樣常見于在羅馬尼亞, 澳大利亞和墨西哥人群.特點(diǎn):Hb Hashar

26、onHb AHb A2Hb FHb HasharonHb Ha-A2整理ppt56Hb A2+ O-ArabHb FHb A整理ppt57DIAGNOSTIC FLOW-CHART整理ppt58整理ppt59現(xiàn)有的新生兒血紅蛋白篩查方法 (SCD) 新生兒血紅蛋白檢測: * 等電聚焦等電聚焦 (IEF) * 高效離子交換液相色譜法高效離子交換液相色譜法 (CE-HPLC). 毛細(xì)管電泳方法可取代常規(guī),操作復(fù)雜的等電聚焦方法整理ppt60取血板BSD600 全自動(dòng)打孔器 全自動(dòng)溶血, 樣品稀釋和檢測溶血?jiǎng)悠窏l碼識別：取血板條碼樣品稀釋杯條碼使用純凈水洗脫樣品整理ppt61與IEF方法比較, 毛

27、細(xì)管方法優(yōu)勢 使用標(biāo)準(zhǔn)取血板, 在室溫下進(jìn)行干燥. 干燥的取血板可在 2-8C下,保存1個(gè)月.新生兒血紅蛋白檢測的樣品要求整理ppt63通過顏色區(qū)分正常及異常樣品正常血樣 :with Hb F and Hb A(+ acetylated Hb F)異常血樣整理ppt64通過樣品 ID, 試劑杯和全自動(dòng)打孔器的數(shù)據(jù)記錄完成數(shù)據(jù)交換異常樣品自動(dòng)顯示電泳圖譜說明 : * 檢測到條帶的位置, 圖譜會(huì)自動(dòng)定位* 鼠標(biāo)經(jīng)過的區(qū)帶位置, 會(huì)顯示出該區(qū)帶的所有可能出現(xiàn)的異常血紅蛋白名稱. (N1 to N13). 整理ppt66新生兒血紅蛋白檢測條帶名稱識別表N 13 : Hb BartsN 12 : /N

28、11 : Hb Hope, Gamma chain variants, denatured Hb AN 10 : Hb AN 9 : Denatured Hb FN 8 : /N 7 : Hb FN 6 : /N 5 : Hb D-Punjab, Hb G-Philadelphia, Hb Korle-BuN 4 : Hb S, acetylated gamma chain variantsN 3 : Hb E, Hb F-Ouled Rabah, gamma chain variants, MethemoglobinN 2 : Hb A2, Hb O-Arab, Hb F-Ouled Rab

29、ah, gamma chain variantsN 1 : Hb C整理ppt67正常血樣Hb FHb ABirth: 19/01/06Sample collection: 24/01/06Term : 39 w.Weight : 3445 g68整理ppt輸血后檢測結(jié)果Birth: 29/01/06Sample collection: 01/02/06Term : 38 w.Weight : 3100 g整理ppt69F/S homozygoteBirth: 05/01/06Sample collection: 08/01/06Term : 37 w.Weight : 3490 gHb SH

30、b FDenatured Hb F70整理ppt早產(chǎn)兒體內(nèi)的F/SDenatured Hb FHb FHb SBirth: 20/02/06Sample collection: 23/02/06Term : 34 w.Weight : 1300 g 71整理pptF/SC compound heterozygoteDenatured Hb FHb FHb SHb CBirth: 30/01/06Sample collection: 02/02/06Term : 40 w.Weight : 3900 g整理ppt72F/AS heterozygoteHb AHb FHb SBirth: 16/1

31、2/06Sample collection: 19/12/06Term : 36 w.Weight : 2780g73整理pptF/C homozygoteHb FHb CDenatured Hb FBirth: 20/12/05Sample collection: 24/12/05Term: 39 w.Weight: 3160 g整理ppt74F/AC heterozygoteBirth: 18/12/06Sample collection: 21/12/06Term: 40 w.Weight: 3035 g75整理pptF/AC in a premature newbornBirth: 17/10/05Sample collection: 20/10/05Term: 30 w.Weight: 2330 g 76整理pptF/AD heterozygoteBirth: 29/01/06Sample collection: 31/01/06Term: 37 w.Weight: 3280 g整理ppt77F/E homozygoteHb EHb FDenatured Hb FBirth: 10/11/06Sample collection: 13/11/06Term: 40 w.Weight: ?78整理pptF/AE heterozygote Birth: 10/03/