PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合

1、PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合李卓王慧琴楊佳慧王鐘秀細(xì)胞融合? 自發(fā)條件下或人工誘導(dǎo)下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的同種基因型或異種基因型的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合，也稱細(xì)胞雜交。? 同種細(xì)胞能夠自發(fā)融合，是機(jī)體重要的生命活動(dòng)，如有性生殖時(shí)配子的融合。? 異種細(xì)胞的融合必須經(jīng)過誘導(dǎo)劑處理，進(jìn)行誘發(fā)融合。細(xì)胞融合技術(shù)? 是指細(xì)胞通過誘導(dǎo)和培養(yǎng)，在離體條件下用人工方法使不同種細(xì)胞發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合從而形成雜種細(xì)胞，使其同時(shí)具有兩種細(xì)胞的遺傳和生物特性。? 常用的人工誘導(dǎo)方法包括：病毒誘導(dǎo)法、電刺激法、聚乙二醇誘導(dǎo)法。細(xì)胞融合發(fā)展史1.自然發(fā)生的細(xì)胞融合早在19 世紀(jì)人們就發(fā)現(xiàn)在自然條件下生物界中有自

2、發(fā)的細(xì)胞融合現(xiàn)象。 Muller 1838 年在腫瘤中觀察到了多核細(xì)胞此后在由病毒感染的病料組織中如天花膿皰的周圍、受水痘損害的皮膚、在麻疹病人的扁桃體中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞這些多核細(xì)胞可能是病毒作用的結(jié)果：但當(dāng)時(shí)還沒有人認(rèn)識到這一點(diǎn)。1875 年Lange 首先觀察到脊椎動(dòng)物蛙類血液細(xì)胞合并，繼之又有一些研究者在無脊椎動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了融合細(xì)胞。2.PEG作為促融劑引起的革命、由于病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合存在著病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價(jià)差異大等原因 ,科學(xué)家們又嘗試尋找比病毒簡便、快速和高效且比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便的化學(xué)PEG加拿大華裔科學(xué)家高國楠等( 1974 年) 的研究取

3、得重大突破他發(fā)現(xiàn)高分子量的聚乙二醇( PEG) 在Ca2 +存在時(shí)能促使植物原生質(zhì)體融合顯著提高融合率從而迅速推動(dòng)了原生質(zhì)體技術(shù)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。至此應(yīng)用原生質(zhì)體和發(fā)展操縱它們的方法已引起實(shí)驗(yàn)生物學(xué)的“無聲革命”。?,? 同時(shí), Pontecorvo ( 1975 年)發(fā)現(xiàn)PEG能誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合并產(chǎn)生雜交細(xì)胞。1976 年Davidson等對此作了進(jìn)一步證實(shí)。以后的研究工作表明, PEG不僅可以促使植物、動(dòng)物、微生物的細(xì)胞融合 ,而且還能促使動(dòng)物細(xì)胞與植物的原生質(zhì)體發(fā)生融合 ,促使微生物原生質(zhì)體與動(dòng)物細(xì)胞融合 , 使植物原生質(zhì)體攝入微生物。 1975 年Ahkono報(bào)道用PEG將母雞

4、的紅血球細(xì)胞和酵母菌的原生質(zhì)體融合成功1976 年Dudus等報(bào)道人的細(xì)胞能和胡蘿卜的原生質(zhì)體發(fā)生融合。Davey ( 1972 年)和Vasil( 1977 年)用植物原生質(zhì)體攝取了細(xì)菌細(xì)胞。? 1975 年，在動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上又創(chuàng)立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。同體細(xì)胞融合一樣, 雜交瘤工作早期使用的促融劑滅活的仙臺(tái)病毒, 已逐漸為化學(xué)促融劑PEG 所取代。Davidson 等于1976年建立的以PEG誘發(fā)哺乳類細(xì)胞融合的方法, 也同樣適用于淋巴細(xì)胞同瘤細(xì)胞的融合。由于淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)能制備純度高、專一性強(qiáng)的抗體 ,適于由未純化的抗原大量制備,因而在短短幾年時(shí)間里 ,即已被廣泛用于制備

5、各種單克隆抗體。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合PEG作用機(jī)制? 聚乙二醇（PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG是一種特殊的脫水劑，可與水借氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，使細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散，進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親和以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起，使細(xì)胞的胞質(zhì)溝通，從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。PEG的最適使用條件? 細(xì)胞的融合效果與PEG的相對分子質(zhì)量及其體積分?jǐn)?shù)成正比，但PEG的相對分子質(zhì)量越大、體積分?jǐn)?shù)越高，對細(xì)胞的毒性也就越大。實(shí)驗(yàn)時(shí)常選用PEG相對分子質(zhì)量為4000

6、-6000，體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，細(xì)胞破碎較少，融合率較高。其他影響細(xì)胞融合的因素? 鈣離子可以使帶微弱負(fù)電荷的PEG與細(xì)胞膜表面分子相互作用，引起細(xì)胞膜表面電子分布的改變，從而使接觸處的質(zhì)膜形成局部融合，出現(xiàn)凹陷，構(gòu)成原生質(zhì)橋，成為細(xì)胞間通道并逐漸擴(kuò)大，直到兩個(gè)細(xì)胞全部融合。當(dāng)鈣離子濃度為50mmol/ml時(shí)，融合效果最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：觀察到兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞發(fā)生質(zhì)膜融合但核尚未融合，有的則是細(xì)胞間不僅發(fā)生質(zhì)膜融合，而且細(xì)胞核也發(fā)生了融合。剛開始融合開始進(jìn)行核融合分析討論?聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，使細(xì)胞發(fā)生融合，形成融合細(xì)胞。本次實(shí)驗(yàn)用聚

7、乙二醇處理雞紅血細(xì)胞并制片利用顯微鏡觀察。? 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，雞血紅細(xì)胞兩個(gè)或者更多出現(xiàn)不同程度的相互融合，但總體來說融合率還是不錯(cuò)的。經(jīng)分析主要是以下原因：? 由于PEG與雞血紅細(xì)胞懸濁液接觸時(shí)間適宜，PEG與雞血紅細(xì)胞充分接觸，從而融合率比較高。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1. 由于離心時(shí)紅細(xì)胞的數(shù)量很少，吸取的時(shí)候要小心，盡量把吸附在管壁上的紅細(xì)胞都吸出來。此外吸取的動(dòng)作不能太大，否則會(huì)破壞離心形成的分層。2. PEG處理時(shí)間不宜過長，最多不能超過90s，否則會(huì)有多個(gè)細(xì)胞彼此融合形成巨大的合胞體，或者細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外泄。3. 經(jīng)PEG處理后加液混勻時(shí)應(yīng)輕輕洗打，以免剛剛?cè)诤系募?xì)胞分開。4. 加P

8、EG應(yīng)該在37oC水浴加，這樣可以防止PEG凝固，導(dǎo)致離心失敗。5. 注意每次離心的時(shí)間和速度，否則得不到想要的紅細(xì)胞。新的細(xì)胞融合方法? 細(xì)胞融合技術(shù)在生物科學(xué)各領(lǐng)域取得進(jìn)展的同時(shí),從事細(xì)胞融合研究的科學(xué)工作者一直沒有放棄尋找具有更高融合效率的方法。雖然用PEG 作介質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞融合具有上述優(yōu)點(diǎn),但PEG 誘導(dǎo)細(xì)胞融合也存在一些內(nèi)在的問題,如PEG 在有效的濃度范圍內(nèi)( 50 % 55 % )對細(xì)胞毒性很大,因此人們又試圖尋找新的方法來替代PEG 介導(dǎo)細(xì)胞融合法。? 電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)? 激光融合技術(shù)? 空間細(xì)胞融合技術(shù)? 離子束細(xì)胞融合技術(shù)? 非對稱細(xì)胞融合技術(shù)? 縱觀細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展

9、歷史, 細(xì)胞融合技術(shù)的不斷改進(jìn)一方面表現(xiàn)在融合劑上, 另一方面體現(xiàn)在新方法上, 再者體現(xiàn)在融合對象的不斷擴(kuò)展上。融合劑走過了從活病毒,滅活病毒生物階段到PEG 化學(xué)物質(zhì)階段; 新方法不斷涌現(xiàn), 從生物學(xué), 化學(xué)方法,物理學(xué)方法過渡到各種方法的綜合應(yīng)用乃至應(yīng)用空間技術(shù)。融合對象從動(dòng)物,植物到微生物,從種內(nèi)擴(kuò)展到種間, 從近緣擴(kuò)展到遠(yuǎn)緣。每一次技術(shù)上的更新和改進(jìn)都會(huì)帶來應(yīng)用上的巨大革命和創(chuàng)新, 達(dá)到為人類服務(wù)的目的。細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景? 從細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展的歷程可以看到, 伴隨著細(xì)胞融合技術(shù)的每一次革新和改進(jìn), 都會(huì)迅速在各個(gè)領(lǐng)域得到充分的應(yīng)用, 然后在實(shí)際應(yīng)用中又不斷發(fā)現(xiàn)新的問題,在解決實(shí)際問題中又促使細(xì)胞融合技術(shù)躍上一個(gè)又一個(gè)新的臺(tái)階, 使其日臻完善。動(dòng)物細(xì)胞融合、植物細(xì)胞融合、微生物細(xì)胞融合以及三者之間的細(xì)胞融合不斷應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究和人類生產(chǎn)實(shí)際。如創(chuàng)造新物種、培育動(dòng)物新品種、植物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖、獲得優(yōu)良的微生物菌種以及藥物單克隆抗體和